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    【摘要】  以人O?GlcNAc糖基转移酶（OGT）基因为靶点，研究小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）对HEK293T细胞中OGT基因表达的抑制作用，以及这种抑制作用对tau蛋白磷酸化与糖基化修饰的影响。方法： 根据人OGT基因序列特点，设计高效且特异性强的siRNA。用脂质体转染siRNA进入HEK293T细胞，通过实时PCR检测siRNA对OGT基因表达的抑制。用蛋白免疫印迹法检测tau蛋白糖基化与磷酸化修饰的变化。结果： 设计的siRNA能够有效抑制OGT基因的表达，与空白组相比，抑制效率可达78.1%左右。OGT基因表达的下调使tau蛋白糖基化水平下降，而磷酸化水平增高。结论： tau蛋白的糖基化负调节其磷酸化,葡萄糖摄入减少或代谢降低可能在阿尔茨海默尔病的发生发展中起关键作用。 

　　【关键词】   阿尔茨海默尔病 tau蛋白 O?GlcNAc糖基转移酶 RNA干扰

　　　阿尔茨海默尔病（Alzheimer′s disease, AD）的病理特征包括大脑局部尤其是海马和皮层神经元退行性病变，细胞内神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)和细胞外老年斑（senile plaque ,SP）沉积。其中NFT的数量和患者的痴呆程度呈明显的正相关，被认为是AD患者神经原退化的病理基础［1,2］。NFT的主要成分是由异常过度磷酸化tau蛋白聚集而形成的双螺旋丝（paired helical filaments，PHFs）。过度磷酸化的tau蛋白除失去了其刺激和促进微管组装的功能外，还变成了毒性分子，可猎获正常的微管相关蛋白，使得微管崩解，神经细胞退化，最终导致AD患者的认知功能受到严重的损害。

　　蛋白质的修饰方式主要有磷酸化、糖基化、泛素化、经典糖基化、硝基化和O?GlcNAc糖基化。其中蛋白质O?GlcNAc 糖基化是发生在细胞质与细胞核内的一种广泛动态的蛋白质翻译后修饰现象。这种糖基化是单个N?乙酰氨基葡萄糖(N?acetylglucosamine,GlcNAc)通过O?糖苷键连接到丝氨酸或苏氨酸(Ser/Thr)羟基上的。 在AD患者脑中，tau蛋白O?GlcNAc糖基化水平明显低于正常的老年人［3］。蛋白质的O?GlcNAc糖基化程度是O?GlcNAc糖基转移酶(OGT)和O?GlcNAc糖苷酶（O?GlcNAcase，OGA）共同作用的结果，OGT的作用是催化GlcNAc连接到肽链的丝氨酸或苏氨酸羟基上，UDP?GlcNAc是它的供体底物，而OGA的作用是将GlcNAc从蛋白质的羟基上去除。用O?GlcNAc糖苷酶抑制剂处理体外培养的大鼠脑片和神经细胞，以增加O?GlcNAc糖基化的水平，则明显抑制tau蛋白多个位点的磷酸化，提示tau的O?GlcNAc糖基化与磷酸化呈明显的负相关。本实验拟通过RNA干扰的方法来降低HEK293T细胞内OGT基因的表达水平，检测tau蛋白多个位点磷酸化与糖基化的变化，从而证明以上的推测，为进一步探讨AD的发病机制提供实验依据。核心期刊论文发表

　　1  材料与方法

　　1.1  材  料

　　1.1.1  细胞、培养基与质粒  HEK293T细胞株为本实验室保存。0.25% Trypsin?EDTA，小牛血清，DMEM培养基，Opti?MEM@Ⅰ均为Invitrogen公司产品。pCI/tau441由日本物理化学研究所Takashima 教授惠赠。pTG19?T载体购自上海捷瑞生物工程有限公司。

　　1.1.2  siRNA、引物及抗体  siRNA为上海吉玛制药技术有限公司合成。阴性对照（siRNA?NC）及5′端标记了荧光素FAM的阴性对照（siRNA?NC?FAM）购自上海吉玛制药技术有限公司。人OGT引物与内参引物GAPDH由上海生物工程有限公司合成。抗体：抗tau［pS396］为美国Biosource Internatinal公司产品，RL2(Affinity Bioreagents, Golden, CO)用作O?GlcNAc 糖基化的检测，R134d(多克隆抗体,识别磷酸化和非磷酸化的tau蛋白)为美国纽约州立基础研究所神经化学系自行研制。辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG为美国Jackson Immuno Reseach Laboratories产品。

　　1.1.3  其他材料  WizardTM Plus Miniprep System (Promega), SYBR? Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)试剂盒(Takara),Wizard?SV Gel and PCR Clean?Up System (Promega公司)。Trizol试剂,LipofectamineTM 2000（Invitrogen公司）,First Strand cDNA Synthesis Kit(MBI)。PCR Kit(上海生工)，BioTraceTM PVDF (Pall公司)。ECL显色试剂盒(Pierce公司)。质粒抽提试剂盒：PureYieldTM Plasmid Midiprep System (Promega公司)。1.2  方  法

　　1.2.1  siRNA及引物的合成  根据Elbashir和Reynolds的siRNA设计原则结合siDirect在线设计系统设计、选取了1对siRNA 序列。OGT?siRNA： 正义链5′?GAAGAAAGUUCGUGGCAAAdTdT?3′；阴性对照序列正义链 : 5′?UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT?3′ 。每1OD干粉状siRNA加入150 μl的DEPC水即为20 μmol/L的工作液。

　　1.2.2  质粒的转化及抽提  pCI/tau441按常规方法转化DH5α感受态细胞, 在克隆并鉴定后大量扩增。用Promega公司质粒中抽试剂盒抽提质粒（根据说明书步骤操作）。测定D (260 nm)以确定质粒DNA 浓度，-20 ℃储存备用。

　　1.2.3  细胞培养及转染  HEK293T细胞接种于含10％小牛血清的DMEM培养基（高糖），置37℃，5%CO2的培养箱中培养。待细胞长到80％～90％融合度，胰酶消化，接种于12孔板中。转染分空白对照组(对细胞不做任何处理)，转染试剂对照组(加入与实验组等量的转染试剂，Mock组)，阴性对照组(转染阴性对照siRNA,siRNA?NC 组)及实验组(转染OGT?siRNA)，同时转染阴性对照FAM进行转染效率检测，转染严格按照LipofectamineTM 2000试剂盒说明操作。

　　1.2.4  实时PCR分析  标准品制备：从HEK293T细胞中抽提总RNA(按Trizol说明书操作)，反转录成cDNA(按Fermentas说明操作)，PCR扩增OGT和GAPDH片段。人OGT上游引物：5′?CGGGCTATCGAACTACAACCA?3′ ，下游：5′?CCCATATTAGAGTAGGCATCAGCAAAG?3′(356 bp)；内参引物GAPDH上游：5′?ACCACAGTCCATGCCATCAC?3′；下游：5′?TCCACCACCCTGTTGCTGTA?3′(452 bp)。OGT基因扩增与GAPDH基因一样，在0.2 ml离心管中进行：依次加入17.25 μl ddH2O，2.0 μl cDNA模板，2.50 μl 10×PCR 缓冲液，1.50 μl MgCl2(25 mmol/L)，2.50 μl dNTPmix(2.00 mmol/L)，0.50 μl上游引物(10 μmol/L)，0.50  μl下游引物(10 μmol/L)，0.25 μl Taq DNA聚合酶(2 U/μl)。将上述混合液轻轻混匀，稍加离心：94℃，5 min→［94℃，40 s→58 ℃，40 s→72 ℃，35 s］ 30 个循环；→ 72℃，7 min; →4 ℃。扩增完成行1%琼脂糖凝胶电泳，胶回收PCR产物，与载体pTG19 ?T 连接。连接产物转化DH5α大肠埃希菌，蓝白斑筛选得到阳性克隆，挑取阳性克隆过夜培养，抽提质粒后交上海生物工程有限公司测序并进一步通过酶切鉴定确认结果。测定抽提质粒的浓度，以10倍梯度稀释制作标准品，-40 ℃保存。转染结束后24 h提取总RNA，紫外分光光度仪测定D(260 nm)／D(280 nm)光密值比值。计算RNA含量，每个样本取2 μg反转录为cDNA(方法同上)。

　　实时PCR检测：将上述合成的cDNA模板与pTG19?OGT及pTG19?GAPDH一同扩增, 10μl SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)，0.4 μl PCR 上游引物(10 μmol/L)， 0.4 μl PCR 下游引物(10 μmol/L)，2 μl cDNA模板，7.2 μl ddH2O。扩增程序：95℃ 10 s ,95℃ 5 s ,58℃ 15 s , 72℃ 20 s ,循环30次。在退火阶段收集荧光信号。用Rotor Gene?3000荧光实时定量PCR仪附带的分析软件对结果进行定量分析。OGT基因表达的计算方法：以同一份标本OGT拷贝数/GAPDH拷贝数表示OGT基因的表达水平，并设对照组OGT拷贝数/GAPDH拷贝数为1，将各样本拷贝数比值标准化, 定义为N OGT (标准化的OGT表达水平)，并以此值作图。实验重复3次，所得结果间比较采用单因素方差分析。

　　1.2.5  Western Blot分析  HEK293T细胞接种于12孔板, 分组同上。细胞生长至50％融合度时进行转染。因为HEK293T细胞内无tau蛋白表达，所以在转染siRNA的同时,每孔还将共转染1.2 μg的质粒pCI/tau441。48 h后吸干净培养基，用温的及预冷的PBS液各洗1遍，加入预冷的细胞裂解液［50 mmol/L Tris?HCl(pH 7.4)，8.5%蔗糖，50 mmol/L NaF，1 mmol/L Na3VO4，0.1% Triton?100，2 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，10 μg/ml aprotinin，10 μg/ml Leupeptin，10 μg/ml pepstain，100 mmol/L O?GlcNAc］，冰上孵育15 min, 收集每孔细胞至1.5 ml的EP管内，沸水中煮5 min，4℃，12 000×g离心15 min。取上清，用改良Folin?酚法测量蛋白浓度。蛋白印迹分析按文献［3］所述方法完成。核心期刊论文发表

　　1.2.6  统计学处理  数据经SPSS10.0统计软件进行分析。各实验组比较用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

　　2  结  果

　　2.1  HEK293T细胞转染效率检测

　　用siRNA?NC?FAM转染HEK293T细胞，24 h后，倒置荧光显微镜下观察转染效率。转染了siRNA?NC?FAM的细胞呈现绿色荧光，转染效率约为85%，见图1。转染效率计算：转染效率=荧光阳性细胞/细胞总数。

　　2.2  OGT?siRNA对OGT基因mRNA水平影响

　　采用浓度为100 nmol/L的siRNA转染HEK293T细胞。实时PCR结果显示, OGT?siRNA片段可有效地降低HEK293T细胞中OGT的表达水平，与空白对照组相比沉默效果可达78.1%左右，差异有统计学意义（P<0.05）。而Mock组，siRNA?NC组与对照组相比，OGT表达无明显下降，差异无统计学意义，结果见图2。

　　2.3  Tau蛋白糖基化与磷酸化修饰的变化

　　细胞转染48 h后，Western blot检测总tau蛋白（磷酸化与非磷酸化的tau蛋白）及tau蛋白糖基化与磷酸化修饰的变化。以β?肌动蛋白作为内参，结果以目的基因／内参灰度值表示。结果显示各组间总tau蛋白(R134d)没有明显的变化，而实验组tau蛋白的糖基化水平（RL2）明显减少。与此同时tau蛋白ser?396（pS396）磷酸化水平明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。各对照组之间无明显差异（图3）。核心期刊论文发表

　　3  讨  论

　　有文献报道，在AD患者脑中葡萄糖摄入和代谢明显降低［4,5］，并且认为是葡萄糖摄入和利用的降低引起神经细胞退化，而不是由于神经细胞退化引起葡萄糖摄入和利用的降低［6］。葡萄糖摄入和代谢降低使需要葡萄糖作为原料的UDP?乙酰氨基己糖的合成减少，造成UDP?GlcNAc的显著下降，而UDP?GlcNAc又是O?GlcNAc糖基化的供体，最终导致AD患者脑中蛋白质O?GlcNAc糖基化修饰数量减少。Tau蛋白同样受O?GlcNAc糖基化的修饰。越来越多的证据表明： tau蛋白的O?GlcNAc糖基化与磷酸化呈明显的负相关，而且这两种修饰之间可能存在一种平衡机制［7］。用饥饿处理小鼠，使小鼠脑内葡萄糖摄入减少,引起小鼠大脑皮质中总tau蛋白和tau蛋白的O?GlcNAc 糖基化水平降低，tau蛋白磷酸化水平升高。并且饥饿引起的tau蛋白O?GlcNAc糖基化和磷酸化改变均在恢复进食后逆转成正常水平［8］，说明葡萄糖摄入和代谢降低在AD的发生发展过程中起关键作用。

　　RNAi是新近发现的一种由双链RNA引发的特异性高效基因表达抑制途径。与传统的反义核苷酸技术相比较，RNAi能更高效、更特异地抑制靶基因的表达［ 9］。我们根据OGT基因序列的特点设计了高效且特异性强的OGT?siRNA干扰片段。我们选取HEK293T细胞作为研究对象，因该细胞转染效率高，且由于没有内源性tau蛋白的表达，可通过外源tau质粒的转入，直接观察tau蛋白表达状况。用荧光标记的FAM阴性对照检测转染效率，转染HEK293T细胞后转染效率可达约85%。转染结束24小时后通过实时PCR检测OGT基因mRNA表达水平，发现OGT?siRNA对OGT基因的沉默效率可达78.1%。转染结束48小时后，用Western blot检测tau蛋白糖基化与磷酸化修饰的变化，总的tau蛋白(磷酸化与非磷酸化的tau蛋白)没有明显的变化,而tau蛋白的糖基化水平明显减少, tau蛋白的ser?396位点磷酸化水平(pS396)显著增高。ser?396位于tau蛋白的C末端，它的磷酸化与tau蛋白的成纤维作用有密切关系［10］，还可能直接导致tau蛋白聚集形成PHFs，影响tau蛋白正常功能。

　　我们的实验用RNAi的方法干扰OGT基因的表达，致使tau蛋白的糖基化修饰减少而磷酸化修饰显著增高。结果证明tau蛋白的糖基化负调节其磷酸化,葡萄糖摄入减少或代谢降低可能在AD的发病过程中起关键的作用。本实验仅对tau蛋白Ser396位点的磷酸化进行了研究，我们还将对更多的相关磷酸化位点进行研究，为阐明AD的发病机制提供科学依据。

　参考文献： 

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