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    【摘要】  目的： 研究积雪草酸（asiatic acid，AA）对人肝癌细胞株（HepG2）的抑制作用，并探讨其与线粒体之间的关系。方法： 采用MTT法检测AA对HepG2细胞增殖的影响，倒置显微镜观察细胞形态的变化；荧光探针MitoTracker检测线粒体数目；荧光探针JC?1检测线粒体膜电位；荧光探针DCFH?DA检测胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量；ATP试剂盒检测胞内ATP水平;RT?PCR和Western Blot法分析电压依赖性阴离子通道（voltage?dependent anion channel，VDAC）表达量的变化。结果： AA能够剂量依赖性抑制肿瘤细胞株的增殖，30 μmol/L AA作用细胞24 h后细胞突起消失、胞体皱缩、变圆。AA能够使HepG2细胞线粒体膜电位下降，胞内ROS含量增加，降低胞内ATP水平，50 μmol/L AA能够增加VDAC蛋白的表达量。结论： AA抑制肿瘤细胞增殖的作用与线粒体有关，线粒体VDAC参与人肝癌细胞凋亡的调控过程。

　　【关键词】 积雪草酸; 线粒体; 电压依赖性阴离子通道; 肝癌细胞株

　　　　肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高。抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡，是抗肿瘤药物作用的共同机制。线粒体在细胞死亡调控中发挥重要的作用，已成为癌症化学疗法的靶点［1］，通过线粒体途径诱发肿瘤细胞凋亡，是目前抗肿瘤药研发的重要方向之一。

　　积雪草酸(asiatic acid, AA),又名亚细亚酸,是我国传统中药积雪草的五环三萜类组分之一。经研究证明, AA具有对抗CCl4和D?GalN诱导的肝损伤［2, 3］、减弱化疗药物抗肿瘤的不良反应［4］、对抗神经细胞的氧化损伤［5］等作用。另外,也发现AA具有抑制黑色素瘤细胞增殖［6］、诱导直肠癌细胞凋亡的作用［7］。本研究探讨了AA对肝癌细胞株HepG2增殖的抑制作用及其与线粒体之间的关系。

　　1  材料与方法

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　　1.1  材 料

　　1.1.1  实验材料

　　HepG2(人肝癌细胞株)由南京大学徐力致老师惠赠。 AA（Sigma 公司产品，美国）；MEM培养基（Gibco 公司产品，美国）；0.25%胰蛋白酶（Amresco 公司产品，美国）；胎牛血清（杭州四季青生物工程公司产品）；MitoTracker Red FM（Invitrigen公司，美国）；JC?1（Molecular Probes 公司，美国）；MTT（Amresco 公司产品，美国）；鼠抗人β?肌动蛋白单克隆抗体（Abcam公司，美国）；鼠抗人VDAC抗体（Abcam公司，美国）；羊抗小鼠 IgG?HRP(horseradish peroxidase)（武汉博士德生物工程有限公司）；ECL 超级发光液（碧云天生物工程公司）；考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒（南京建成生物工程研究所）；其余未特殊注明的试剂均为进口或国产分析纯。

　　1.1.2  主要仪器

　　Spectra Max 190酶标仪（Molecular device，美国）；Spectra MaxGemini荧光酶标仪（Molecular device，美国）；核酸蛋白分析仪（岛津公司，日本）；Bio?Rad电泳仪（Bio?Rad，美国）；TE2000荧光显微镜（尼康公司，日本）。

　　1.2  实验方法

　　1.2.1  细胞培养

　　HepG2细胞用含10%小牛血清的MEM培养基培养。将细胞接种于培养瓶中， 置于37 ℃、5% CO2，饱和湿度的孵箱中培养，2～3 d传代1次。

　　1.2.2  MTT法测细胞存活率

　　4×104 ml-1细胞100  μl 接种于96孔细胞培养板中培养24 h，加不同浓度AA处理24 h，弃去培养基，每孔加100  μl MTT（D?hank′s液溶解，浓度为1 g/L），37 ℃继续孵育4 h后，吸去培养液，每孔加DMSO 100  μl，待结晶物充分溶解，1 h后用酶标仪于570 nm处测光密度。结果用抑制率表示，计算公式如下：

　　抑制率＝对照组平均D570-给药组平均D570对照组平均D570-空白组平均D570×100%

　　1.2.3  MitoTracker染色检测线粒体数目

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　　HepG2细胞经10，30，50 μmol/L AA处理24 h 后，用MitoTracker探针检测线粒体数目的变化，吸去培养孔中的培养基，加入37℃预温的含100 nmol/L MitoTracker的培养基100  μl，37℃孵育30 min。PBS洗2次，荧光酶标仪检测荧光强度（Ex588 nm/Em644 nm）。

　　1.2.4  JC?1染色测线粒体膜电位

　　4×103个HepG2细胞接种于 96 孔培养板中，以不同浓度AA作用于HepG2细胞24 h后，吸掉培养基,加入2.5 μg/ml的JC?1染料，37 ℃下避光孵育10 min，PBS洗2次，荧光酶标仪检测荧光强度（Ex488 nm/Em525，590 nm）。

　　1.2.5  ATP检测试剂盒测定胞内ATP水平

　　1.5×104个HepG2细胞接种于6 孔培养板中，以不同浓度AA作用24 h后，吸掉培养基，每孔加入200  μl裂解液裂解细胞。加100  μl ATP检测试剂到检测孔内，室温放置3～5 min后，再在检测孔内加上100  μl裂解细胞样品，迅速用枪混匀，间隔2 s后，立即用化学发光酶标仪测定荧光强度。

　　1.2.6  DCFH?DA探针法检测胞内ROS含量

　　4×104 ml-1  HepG2细胞培养24 h，经不同浓度的AA处理24 h后，加入无血清培养基稀释的DCFH?DA溶液，使其终浓度为10  μmol/L，37 ℃下负载探针30 min，PBS洗２次。用荧光酶标仪检测荧光强度（Ex488 nm/Em525 nm），同时用荧光显微镜观察细胞的形态及荧光。

　　1.2.7  肝癌细胞VDAC基因检测

　　1.2.7.1  mRNA水平

　　反转录采用Invitrogen公司试剂盒说明书所述步骤；聚合酶链式反应(PCR)扩增反应体系：2.5   μl  10×缓冲液，1   μl  dNTP，2   μl  MgCl2，0.5    μl  Taq DNA聚合酶，1   μl  cDNA模板，1   μl  引物(VDAC)?A，1   μl  引物(VDAC)?S，1  μl 引物(β?肌动蛋白)?A，1  μl 引物(β?肌动蛋白)?S，13  μl 无菌水；引物序列为引物(VDAC)?S：5′?AGTGTGACGTTGACATCCGTA?3′，引物(VDAC)?A：5′ ?GCCAGAGCAGTAATCTCCTTCT?3′；引物(β?肌动蛋白?S: 5′?GGCTACGGCTTTGGCTTAAT?3′，引物(β?肌动蛋白)?A: 5′?CCCTCTTGTACCCTGTCTTGA?3′。反应先经过95 ℃ 2 min，然后是28个循环：94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，最后于72 ℃延伸反应4 min。PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

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　　1.2.7.2  蛋白水平

　　采用蛋白质印迹法检测。提取各组细胞总蛋白，进行蛋白定量后，样品按比例加入3× SDS凝胶上样缓冲液溶解，煮沸5 min。以20 μg蛋白进行上样，电泳。50 V恒压4 h将蛋白转至PVDF膜；封闭液(1 g脱脂奶粉，0.2 g BSA溶于20 ml PBST溶液)封闭1 h；一抗孵育（抗VDAC抗体1∶2000；抗β?肌动蛋白抗体1∶5000）4 ℃过夜；PBST清洗5次，每次10 min；二抗孵育（1∶3000），室温1 h；PBST清洗5次，每次10 min；ECL发光液发光，暗室内X光片感光、显影、定影、观察。

　　1.2.8  统计方法

　　数据资料以±s表示，用SAS软件进行单因素方差分析（one way analysis of variance, ANOVA），组间比较进行q检查，显著性标准为α=0.05，所有实验重复3次。

　　2  结 果

　　2.1  AA抑制肿瘤细胞增殖

　　如图1所示，HepG2细胞经终浓度分别为20，30，40 μmol/L的AA溶液处理后，细胞生长受到抑制，细胞形态改变，如突起消失，胞体皱缩变圆等。

　　由图2 MTT结果发现, 与对照组比较，低浓度AA（20 μmol/L）组对HepG2细胞的生长没有明显影响；当剂量达到40 μmol/L 时，AA对HepG2细胞增殖有显著抑制作用，抑制率达78%，由此AA在HepG2细胞株上的IC50值为27 μmol/L。

　　2.2  AA对HepG2 细胞线粒体数量的影响

　　结果如图3所示，与对照组比较，10 μmol/L AA组细胞荧光强度增加了11%，30 μmol/L AA组细胞荧光强度增加了146%，50 μmol/L AA 组细胞荧光强度减少了44%，即线粒体数量随着AA浓度的升高，有一个先升高后降低的过程。

　　2.3  AA对HepG2细胞线粒体膜电位的影响

　　HepG2细胞经不同浓度AA处理24 h后，加JC?1荧光探针检测线粒体膜电位的变化，结果见图4。从图4b荧光照片可见：对照组线粒体全为红色，说明膜电位较高；经20 μmol/L 解耦联剂CCCP处理2 h只见绿色荧光，膜电位降低；经40 μmol/L AA处理24 h后的HepG2细胞线粒体呈草绿色或橙黄色荧光，说明线粒体膜电位发生不同程度地垮陷，线粒体功能受到影响。从图4a红/绿荧光强度比值分析直方图可知 30，40 μmol/L AA极显著地降低了HepG2细胞线粒体的膜电位。

　　2.4  AA对HepG2细胞线粒体功能的影响

　　由图5可知，与对照组比，HepG2细胞经不同浓度AA处理24 h后胞内ATP水平呈剂量依赖性地降低。胞内ROS含量呈剂量依赖性升高。

　　2.5  AA对HepG2细胞线粒体VDAC蛋白表达的影响

　　由图6a可看出，与对照组相比， 10，30，50 μmol/L AA对VDAC转录水平基本无影响，仅30 μmol/L AA处理组VDAC mRNA转录水平略有降低。由图6b可知以对照组VDAC与内参β?肌动蛋白免疫条带灰度扫描的比值为100%，则10，30，50 μmol/L AA组分别为97%，187%，397%，说明AA 剂量依赖性地上调了VDAC蛋白的水平。

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　　3 讨 论

　　我们在HepG2肿瘤细胞株上研究了AA的体外抗肿瘤作用，发现AA浓度依赖性抑制HepG2细胞株的增殖。这与之前的研究结果一致［4］。线粒体是调控细胞凋亡的关键因素，当线粒体受到药物毒性作用时，线粒体功能出现缺陷，线粒体数目增多可能是为了补偿这种缺陷而产生的反馈机制［8, 9］。因此30 μmol/L AA作用下线粒体数目增加，但膜电位明显降低，说明线粒体功能异常；当药物浓度继续增高时，线粒体损伤加重，反馈机制受到影响，线粒体的分裂不能正常进行［10］。50 μmol/L AA严重损伤线粒体，使之不能分裂，各种功能受损，线粒体数量大大减少。

　　AA通过诱导线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeably transition pore，mPTP）开放，导致线粒体膜电位垮陷，ATP水平下降，胞内ROS产量增多或清除率降低，最终诱导HepG2细胞死亡，可见AA可以通过线粒体介导通路诱导细胞死亡。

　　线粒体通透性转换孔mPTP由VDAC、腺嘌呤核苷酸易位子（adenine nucleotide translocator，ANT）、亲环蛋白D（cyclophilin D，Cyp D）等组成，是线粒体凋亡蛋白释放的主要通道。VDAC主要以两种方式调控线粒体介导的细胞死亡：一方面作为外膜上主要的蛋白孔道参与调控外膜的通透性，另一方面是与凋亡蛋白Bcl?2家族蛋白相互作用调控细胞凋亡。Yagoda等［11］指出VDAC可成为药物筛选的靶点。本实验室的研究表明，AA的保肝作用与逆转VDAC水平有关［2, 12］。实验结果表明，AA可以剂量依赖性诱导HepG2细胞线粒体VDAC蛋白表达量升高，AA的线粒体毒性很可能与VDAC有关。结合细胞内线粒体数目分析可以推断， 30 μmol/L AA作用时，HepG2细胞VDAC蛋白量的增加与线粒体数量增加有关；50 μmol/L AA作用时，HepG2细胞线粒体受到严重损伤，线粒体数目急剧减少，而VDAC蛋白孔道表达量显著增加，说明线粒体外膜VDAC蛋白形成的孔道增加。因此，AA的抗肿瘤作用与VDAC相关，但是其在线粒体上的靶点是否就是VDAC，值得进一步探讨。

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