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　　    【摘要】  【目的】 在大鼠70%肝部分切除基础上建立入肝门静脉动脉化加门腔分流术的模型，并研究大鼠肝脏再生情况。【方法】 155只Sprague-Dawley大鼠分为3组。实验组大鼠65只，利用右肾动脉行入肝门静脉动脉化，并行门腔分流及肝部分切除，肝切组大鼠65只，仅进行肝部分切除，对照组大鼠25只，仅右肾切除。分别观察实验组及肝切组术后2、7、14及28 d残肝再生比率变化，以及3组在术中0 h、术后24、48、72 h及7 d各时相点残肝肝脏S期细胞比例及增殖细胞核抗原(PCNA)阳性表达的肝细胞比例情况。【结果】 术后2、7、14 d两组肝脏再生比率相比，实验组较肝切组明显增高，差异有显著统计学意义(P < 0.01);至术后28 d，实验组及肝切组肝脏再生比率趋平，差异无统计学意义(P > 0.05)。术后各时相点实验组及肝切组残肝S期肝细胞比例及PCNA阳性表达肝细胞比例均较对照组明显升高，差异有显著统计学意义(P < 0.01)。实验组与肝切组相比，术后24 h残肝S期细胞比例及PCNA阳性细胞比例均已经开始升高，至术后48、72 h及术后7 d，实验组仍明显高于肝切组，差异有显著统计学意义(P < 0.01)。【结论】 入肝门静脉动脉化重建入肝血流对大鼠肝细胞的增生及增殖有促进作用，是预防肝部分切除术后急性肝功能衰竭的有效方法。

　　　　【关键词】  哮喘; IL-17; 中性粒细胞

　　　　门静脉动脉化最初应用于肝硬化门静脉高压症门体分流术后预防肝功能衰竭和肝性脑病的发生[1]，以及用于进展期肝胆恶性肿瘤行扩大肝部分或肝门部根治性整块切除后预防急性肝功能衰竭[2]，近年来更多用于肝移植术中处理门静脉栓塞[3]，但多为动物模型研究。已经有部分学者在临床上实验性的应用了门静脉动脉化技术，取得了一定的疗效[4-5]。但对于门静脉动脉化对肝脏细胞再生的影响如何，至今研究仍较少。为了解门静脉动脉化对肝脏细胞再生影响，结合之前所建立的利用右肾动脉行入肝门静脉完全动脉化加门腔分流术的大鼠模型，我们在此基础上附加肝部分切除，对大鼠肝脏再生情况进行研究，报道如下。高级职称论文发表

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组

　　雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠共155只，体质量250 ～ 300 g，分3组：实验组65只，行右肾切除，利用右肾动脉行入肝门静脉动脉化，门腔完全分流，再按Higgins[6]方法行70%部分肝(肝左叶 + 中叶)切除;肝切除组65只，行右肾切除 + 70%部分肝(肝左叶 + 中叶)切除;对照组25只，仅行右肾切除。高级职称论文发表

　　1.2 入肝门静脉动脉化模型建立

　　所有大鼠术前均禁食24 h，不禁水，口罩吸入乙醚麻醉。取腹部正中切口进腹，在手术显微镜下，游离门静脉上至门静脉入肝左右分支处，下至脾静脉与肠系膜上静脉汇合处。游离右肾动脉、右肾静脉和右输尿管，右肾动脉由腹主动脉开口处游离至肾动脉分叉以远3 mm，并结扎切断由肾动脉发出的肾上腺动脉。右肾静脉由下腔静脉游离至肾门，游离输尿管并结扎切断。在距腹主动脉5 mm处阻断右肾动脉，于右肾动脉分叉以远2 mm处切断右肾动脉，于右肾静脉汇入下腔静脉处阻断右肾静脉，距血管夹以远2 mm处横断右肾静脉，切除右肾。肝素生理盐水反复冲洗各游离的血管腔。将右肾动脉从下腔静脉后方拉至其左前方，并将动脉分叉部用显微组织剪剖开并修剪成鱼口状备用，长径约3 ～ 4 mm，横径约2 mm。在门静脉主干分支处和脾静脉与肠系膜上静脉汇合处分别用无损伤血管夹阻断，在两血管夹中下三分之一处横断门静脉。修剪各断端血管外膜，以备吻合。高级职称论文发表

　　在10 ～ 16倍双人双目手术显微镜辅助下，用10-0带针无创尼龙缝线将入肝门静脉主干与右肾动脉椭圆形剖面两定点连续端端吻合，缝合完毕后依次松开入肝门静脉主干与右肾动脉血管夹，成功将入肝门静脉动脉化(阻断时间8 ～ 12 min)。之后用10-0带针无创尼龙缝线将右肾静脉与远端门静脉主干(脾静脉与肠系膜上静脉汇合处)两定点连续端端吻合，完毕后松开阻断血管夹，完成门腔完全分流(阻断时间在10 ～ 12 min)。以双镊法证实吻合口通畅并检查有无漏血，若有漏血，可间断补针。肝部分切除参照Higgins[6]大鼠肝部分切除方法，切除大鼠肝脏的左叶和中叶，切除量占全肝70%。术毕经大鼠尾静脉注射1 mL生理盐水，可翻身饮水，1 d后正常饮食，单笼饲养。高级职称论文发表

　　1.3 指标测定

　　1.3.1 肝脏再生比率的测定

　　预实验时取10只正常大鼠称体质量为(261 ± 31) g，切除全肝称湿质量，为(10.96 ± 2.24) g，再将肝脏切除左外叶、左内叶及中叶称湿质量，为(7.13 ± 1.43) g。得出肝切除部分湿质量占全肝的(68.4 ± 1.7)%，同时求得全肝湿质量占体质量的(4.76 ± 0.34)%。手术制模前大鼠称质量，根据全肝/体质量比例算出全肝理论质量，手术后称取切除之部分肝脏湿质量，实验组及肝切组分别在术后2、7、14、28 d取10只大鼠处死后取残肝标本并称取肝湿质量。根据公式计算肝再生比率： 肝再生率(%) = [mC - (mA - mB)]/(mA - mB) × 100%， 其中mA为大鼠理论全肝质量，mB为切除肝质量，mC为处死大鼠取标本时的残余肝质量。高级职称论文发表

　　1.3.2 再生肝S期肝细胞比例

　　3组各取5只大鼠分别于术中取1 cm3大小肝组织，术后6、24、48、72 h和7 d处死后于残余肝上取部分组织以0.5 g/L胶原酶消化，制作单细胞悬液，供流式细胞术FCM检测。使用FACS Calibur 型流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)，用碘化丙啶(PI)定量DNA荧光染色法(美国BD CycletestTM Plus DNA Reagent Kit)，鸡红细胞做标准样品，调整仪器的CV值在5%以内，激光功率为200 W，激发光波长488 nm，滤光片波长620 nm，测定细胞荧光信号。每份样品检测20 000个细胞，计数活细胞总数，S期(DNA合成期)肝细胞数，求出每例样本S期肝细胞百分比例 = S期肝细胞/活细胞总数 × 100%。高级职称论文发表

　　1.3.3 肝细胞PCNA免疫组化检测

　　3组同样分别于术中取1 cm3大小肝组织，术后6、24、48、72 h和7 d处死时留取肝脏标本，均中性甲醛溶液固定、石蜡包埋。连续切片，厚4 μm。切片常规脱蜡后蒸馏水冲洗5 min;用300 mL/L过氧化氢孵育30 min以抑制内源性过氧化物酶;用10 mL/L正常小牛血清孵育20 min封闭内源性过氧化酶;加一抗(美国 Dako公司，PCNA PC10 MAb)稀释液(1 ∶ 50)4 ℃湿盒内室温孵育过夜，PBS冲洗3次 × 5 min;加生物素标记的二抗(福州迈新公司，KIT-0100M，Ultra Sensitive S-P Mouse)室温孵育30 min;加ABC复合物室温作用30 min，PBS彻底冲洗;DAB显色液(福州迈新，DAB-2031加强型 DAB Plus Kit)染色2 ～ 10 min，苏木素轻度复染;系列酒精脱水，二甲苯透明;树胶封片观察。由两名病理医师双盲法分别观察免疫组织化学染色结果，在高倍镜下(10 × 40)随机观察4个视野共1 000个细胞，核内有棕黄色颗粒沉积者为阳性细胞，取其两人计数结果的平均值，用百分率表示PCNA阳性率。计算方法：PCNA阳性表达细胞比例 = 阳性细胞数/观察的细胞总数 × 100%。高级职称论文发表

　　1.4 统计学处理

　　应用SPSS 13.0版软件，数据以x ± s表示，两组间计量资料统计采用t检验， 3组间均数比较先行单因素方差分析后再行LSD-t (least significant difference-t)检验，取?琢 = 0.05。高级职称论文发表

　　2 结 果

　　2.1 残肝再生率变化

　　实验组及肝切组术后肝脏再生率均呈上升趋势，术后2 d至术后14 d，实验组肝再生率与对照组相比明显升高，差异有显著统计学意义(P < 0.01)。至术后28 d，实验组及肝切组肝脏再生率趋平，差异无统计学意义(P > 0.05，表1)。高级职称论文发表

　　2.2 残肝S期肝细胞比例变化

　　各组术后S期肝细胞比例的变化(表2)。从表中可以看出实验组及肝切组S期肝细胞比例的变化，其高峰出现在术后24 ～ 72 h，以后逐渐下降，但到7 d时仍明显高于本组0时相点的水平(P < 0.01)，说明肝细胞的再生主要发生在术后一周。特别是在术后3 d以内，是肝细胞再生的关键时期。三组在术后各个时相点总体均数存在统计学差异(F = 23.82，P < 0.01)。其中实验组与肝切除组相比，在术后各时相点均有明显升高，差异有显著统计学意义(P < 0.01)。与对照组相比，实验组与肝切组术后各时相点S期肝细胞含量均明显升高，差异有显著统计学意义(P < 0.01)。高级职称论文发表

　　2.3 PCNA阳性表达细胞比例变化

　　对照组PCNA表达阳性细胞比例在3%左右。实验组及肝切组术后24 h阳性细胞比例已经明显增高，至72 h达到高峰，此后逐渐下降，但仍明显高于本组0时相点水平，差异有显著统计学意义(P < 0.01)，表明术后1周细胞仍持续增殖。两组术后各时间点与对照组相比，PCNA阳性细胞比例均明显升高，差异有显著统计学意义(P < 0.01)，而实验组PCNA阳性细胞比例与肝切组比较，从术后24 h至术后7 d，各时间点相比较，实验组均明显高于肝切组，差异有显著统计学意义(P < 0.01，表3;图1)。高级职称论文发表

　　3 讨 论

　　肝脏作为体内血流最丰富的器官，有肝动脉及门静脉双重血供，约75%的血液供应来自乏氧的门静脉。以往一直认为，门静脉血中的肝脏营养因子对肝细胞的再生及增殖是必不可少的，但早在1952年，Cohn等就最早提出用动脉血代替门脉血灌注肝脏的设想，随后的动物实验证明，以适当压力和流量的动脉血灌注肝脏，可使分流后的动物维持正常肝血流量，促使肝细胞再生，保证正常肝脏的解毒功能。张红卫等[7]在肝硬化大鼠行部分门静脉结扎后发现，非结扎的相应肝叶代偿增生，可提高Ⅱ期肝切除手术的范围。近年来的动物实验结果也显示[8]，在扩大部分肝切除的模型中，采用门静脉动脉化的技术增加肝脏氧供及血流，能有效促进肝细胞的增生。本实验结果亦表明，在完全门腔分流后行入肝门静脉动脉化，肝脏虽然没有静脉血的灌注，但充分的动脉血供能有效促进肝细胞再生，尤其是在术后1周内，肝细胞再生相关指标如S期肝细胞比例及肝细胞PCNA表达的比例均较单纯肝切除者明显升高，与国外部分学者研究结果相符。高级职称论文发表

　　陈永亮等[9-10]研究表明肝脏部分切除后不论是在正常或梗阻性黄疸后再通的大鼠还是在同时行门静脉动脉化的大鼠，术后肝质量的测定、有丝分裂期肝细胞的计数和流式细胞仪对各期DNA含量的检测均表明肝细胞再生非常明显而且比较相似，说明门静脉血的供应对肝脏的再生并不是必须的，门静脉动脉化后不影响肝脏的再生。王鹏等[11]利用胃十二指肠动脉与门静脉行端侧吻合术加肝左外叶切除犬只模型研究门静脉动脉化对肝硬化犬肝切除后肝再生结果表明，PCNA表达增强，门静脉动脉化对肝细胞的再生有促进作用。Fan等[8]用部分肝切除大鼠模型研究门静脉动脉化后肝脏再生情况的结果表明，充足的肝血流量是肝再生的前提因素，在门静脉血流量相同的情况下，无论是静脉血还是动脉血均能保证肝脏的正常再生能力。而我们的残肝再生率的研究结果亦表明，在术后28 d内，相对单纯肝切除，附加入肝门静脉化能显著提高残肝的增生及肝脏重量，这对于扩大的部分肝切除术后预防和减少术后早期发生急性肝功能衰竭有着重要意义。高级职称论文发表

　　门静脉动脉化主要机制是通过动脉血强化灌注门静脉，增加门静脉的压力和改善肝脏缺血、缺氧。肝细胞主要由线粒体的呼吸链供能，其作用约消耗肝脏90%的供氧，而肝细胞再生的启动有赖于白细胞介素-6及肿瘤坏死因子-?琢等因子表达增加[12]。因此，稳定的氧供对肝脏能量代谢非常重要。在门静脉动脉化后，富含氧供和高流量血供对肝脏的灌注能有效促进肝细胞再生及增殖，另一方面，结合完全性的门腔分流，有效避免了门静脉属支压力升高而引起的消化道静脉曲张出血。实验结果表明，门静脉动脉化对肝脏再生具有促进作用。

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