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    【摘要】目的 分析宁夏地区牛脑组织博尔纳病病毒（Borna disease virus，BDV）的感染状况，探讨阳性基因扩增片段与德国马源性标准病毒株He/80同源性。方法 采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量巢式逆转录酶聚合酶链反应（FQ-nRT-PCR）分别检测宁夏地区145例健康牛脑组织中 BDVp40、BDVp24基因片段，对BDVp24阳性扩增产物进行基因序列测定，并应用BLAST和DNAsist 5.0 软件对测序结果进行分析。结果 145例牛脑组织中4例BDVp40、BDVp24均阳性,阳性率为2.759%，且阳性BDVp24 片段的核苷酸序列与He/80 同源性最高，所编码氨基酸序列相同。结论 宁夏地区牛脑组织中可能存在动物源性BDV的自然感染，阳性BDV p24核苷酸序列与He/80具有高度同源性，所编码的氨基酸序列相同。 

　　【关键词】  博尔纳病病毒；荧光定量巢式逆转录酶聚合酶链反应；牛脑组织

　　　博尔纳病病毒（Borna disease virus，BDV）是非分节段、单负链RNA病毒，具有非细胞溶解性、强嗜神经性特点，能感染从鸟到灵长类的广泛动物种类并引起以中枢系统功能障碍为特征的临床表现［1］。研究表明，在我国黑龙江、新疆、重庆、宁夏等地存在BDV的自然感染［2-4］。本课题组前期研究证实在宁夏地区牛、羊外周血单核细胞（PBMCs）及病毒性脑炎病人外周血单核细胞和脑脊液中存在BDV的自然感染，与德国马源性标准病毒株He/80序列比对，具有高度同源性［5-6］。BDV侵入机体首先进入血液或侵入嗅觉上皮或某些神经末梢，继而通过血液系统或神经轴突物质转运进入神经系统，造成行为异常、脑实质和脑膜的炎性细胞浸润，疾病特异性的抗原在边缘系统神经元中积聚，引起致死性中枢神经系统损害［7］。BDV 感染时外周血PBMCs 检测的阳性率与脑组织的阳性率是否一致呢？故本实验对宁夏健康成年牛脑组织BDVp40、BDVp24两个高度保守序列进行检测。

　　1  材料和方法

　　1.1  研究对象

　　145例健康成年牛均来自宁夏地区，年龄大于2岁，圈养，性别不限，每例取同侧颞叶、额叶、顶叶脑组织共约50g，于－70℃保存备用，分析时各取适量研磨混匀。

　　1.2  试剂

　　Trizol RNA提取抽提剂（购自BioFlux），BDVp24荧光定量PCR检测试剂盒（购自广州达晖生物技术有限公司）。BDVp24重组质粒由重庆医科大学神经科学研究中心提供。

　　检测BDVp24基因序列引物：

　　外引物：p1 5'-TCAGACCCAGACCAGCGAA-3'，

　　p2 5'-ATCTGGGGATAAATGCGCG-3'；

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　　内引物：p1 5'-CCCTCCAAGTGGAAACCAT-3'，

　　p2 5'-CAGTATCTTGATGTTCTCGCCA-3'；

　　探针序列为：5'-(FAM) TCAGCGGTGCGACCACTCCGATAGC(TAMRA)-3'

　　BDV p40序列引物为：

　　p1:5'-AGTCACCGCGCGATAGTTT-3',

　　p2:5'-CGACAGGTAGGATTCACGAGGC-3'

　　以上引物均由美国Invitrogen公司合成。

　　1.3  仪器

　　752紫外光栅分光光度计（上海第三分析仪器厂）；Bio-Rad PCR仪（日本）；Heraeus低温高速离心机（德国）；Rotor-Gene 6000荧光PCR仪（澳大利亚）；SANYO ULTRA LOW冰箱（日本）。

　　1.4  方法

　　1.4.1  脑组织总RNA的提取及检测

　　1.4.1.1  总RNA提取

　　将－70℃保存的牛脑组织钳取适量放入1.5mL EP管中，加入1mL Trizol,室温孵育10min，用研磨棒将组织研磨至匀浆，加入氯仿0.3mL，盖紧盖子，颠倒混摇15s，室温孵育 2～3min,4℃12000r·min-1离心15min，将上清液移至新微量离心管，加异丙醇0.75mL，室温孵育10min，4℃ 12000r·min-1离心10min，弃上清液，用75%乙醇1.5mL洗涤沉淀1次，4℃ 7500r·min-1离心5min，弃乙醇，室温空气干燥5～10min，加DEPC处理水溶解RNA，-70℃冰箱保存备用。

　　1.4.1.2  RNA完整性检测

　　随机取上述提取RNA样品4份，4℃8000r·min-1离心5min，弃上清；加75%乙醇洗涤，4℃8000r·min-1离心 5min，弃上清，吸干残余液，室温干燥15min；加入无RNase水50μL，55℃水浴10～15min；每份取5μL RNA稀释100倍，用紫外分光光度计测定OD260、OD280，计算OD260/OD280，根据公式OD260×核酸稀释倍数×40/1000(μg·μL-1)，计算RNA浓度以分析其纯度。然后每份取5μL加样，进行1%琼脂糖凝胶（含溴化乙锭浓度为0.5%）电泳，以3～4V·cm-1电压电泳25min，分析RNA完整性。

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　　1.4.2  BDVp24定量标准曲线的建立

　　将BDVp24重组质粒经测定OD值计算拷贝数定量后，按107 、106、105、104、103 、102 拷贝·μL-1浓度梯度稀释，作为阳性模板，在Rotor-Gene6000荧光PCR仪上进行扩增，由电脑自动采集数据，根据阳性定量标准模板的扩增情况绘制标准曲线。

　　1.4.3  FQ-nRT-PCR检测BDVp24基因片段（按照BDV荧光定量PCR检测试剂盒说明进行）

　　将待测RNA样品首先进行逆转录反应，逆转录体系:反应液17μL，逆转录酶1μL，DEPC水7μL，总反应体积为20μL，37℃1h。然后进行第一次PCR扩增，反应体系：逆转录产物5μL，加入反应液Ⅱ8μL，TaqDNA聚合酶1μL，去离子水11μL，反应体积为25μL；反应条件: 预变性93℃ 4min，变性94℃ 30s，退火54℃ 30s，延伸72℃ 1min，进行20个循环。第二次PCR扩增：反应体系：上述扩增产物5μL，加入反应液Ⅲ 14μL，TaqDNA聚合酶 1μL，去离子水30μL，反应体积为50μL；反应条件：预变性93℃ 3min，变性93℃ 45s，延伸55℃ 60s，进行40个循环。每步反应均设有阴性对照，第二次PCR扩增同时测定荧光值，对照标准曲线拷贝数在104以上为阳性。

　　PCR扩增阳性产物的鉴定和序列分析：取上述阳性产物5μL，110V、60mA条件下进行2%琼脂糖电泳35min，检测BDVp40。反应体系：总反应体系20μL，模板1μL，引物2μL，反应液10μL，去离子水7μL，反应条件：梯度PCR方法：94℃，5min预变性，然后 94℃，30s；66℃，30s；72℃，1min；2个循环，然后94℃，30s；64℃，30s；72℃，1min；2个循环，然后 94℃，30s；62℃，30s；72℃，1min；2个循环，94℃，30s；60℃，30s；72℃，1min；2个循环，94℃，30s；58℃，30s；72℃，1min；2个循环，最后94℃，30s；56℃，30s；72℃，1min；30个循环。反应产物3%琼脂糖电泳，对照标准品片段大小154bp判断阳性条带，记录结果。同时将上述BDVp24基因片段阳性的扩增产物进行基因克隆和测序（上海英骏生物技术有限公司）。

　　2  结果

　　2．1  RNA提取纯度和完整性检测结果

　　随机抽取的牛脑组织RNA样品，测定其OD值，A260/A280值分别为1.80、1.82、1.86、1.96，介于1.8～2.0之间，说明其纯度较好。同时进行1%琼脂糖凝胶电泳，可见3个明显的亮条带，分别为28S、18S和5S，说明其完整性较好，可用于进一步实验。

　　2.2  FQ-nRT-PCR定量分析结果

　　借助Rotor-Gene6000 Series Software 1.7版本分析软件进行定量分析，每次五个梯度阳性对照均扩增成功,扩增曲线呈S形，阴性对照无荧光量改变，其循环次数（ct值）和浓度对数值之间的相关系数均在0.999以上,说明ct值和定量浓度对数值二者之间相关性良好（图1，见封2）。其中4例牛脑组织RNA样本阳性，浓度分别为：2.21E+04、2.29E+05、3.41E+04、

　　2.34E+05 copes·μL-1；BDVp24基因片段检测结果为阳性。其余141例牛脑组织标本为阴性。

　　2.3  BDVp40基因的FQ-PCR扩增  将4例阳性标本扩增产物进行BDVp40琼脂糖凝胶电泳，可见目的片段在154bp附近，见图2。

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　　2.4  牛脑组织BDVp24阳性标本克隆测序结果及系统发生学分析

　　将BDVp24和P40检测均为阳性标本的P24序列产物做纯化、连接测序，结果与He/80株进行序列对比分析并应用MEGA4.0软件分析构建BDVp24基因的种系发生树（图3），结果显示，在所有牛脑组织BDVp24阳性序列与标准株He/80基因聚合分析提示宁夏牛脑组织BDVp24 基因与德国He/80株形成了德国－宁夏的混合支系，而在作者前期宁夏绵羊PBMC检测出的p24序列形成了宁夏的独立支，在混合支系中，基因的序列和同源性都很高，因此，推断宁夏地区牛脑组织中p24序列与德国马源性的He/80株有极高的同源性（100%）。(NX02BT 为宁夏牛脑组织；070、064、046、038为标本编号)

　　3  讨论

　　BDV属于单负链病毒目博尔纳病毒科，存在广泛的感染宿主，自然感染以马羊为主，研究表明可感染包括人类在内的所有温血动物，感染呈全球性分布。研究表明BDV的传播媒介可能是蜱、鸟等，而且动物或人类可能通过接触感染动物的唾液、鼻咽分泌物或被污染的食物和水源而感染，同时存在潜在的血源性传播和垂直传播的可能。病毒侵入机体后，机体免疫系统会识别病原微生物从而启动免疫应答，而脑组织的感染与血液病毒自然感染的阳性率差异在一定程度上可以反应机体免疫系统与病毒的斗争结果。

　　本研究对 145例来自宁夏地区的健康成年牛脑组织进行BDVp24、BDVp40基因片段检测发现4例阳性，阳性率2.759%。基于FQ-nRT-PCR技术的敏感性和特异性相对于常规PCR技术、免疫组化、血清学检查等方法有很大程度的提高，同时由于是闭管操作，避免了产物扩增后的处理过程中出现污染的情况，此外完成实验后对阳性标本又进行了进一步的排查，同时通过与德国马源性标准病毒株He/80进行基因序列比对，同源性97.67%，证实宁夏地区可能存在 BDV的自然感染。

　　构建系统发生树就是从生物物种的序列信息推断生物进化历史， “重塑”系统进化的（谱系）关系，并把进化关系用系统发生树的形式表示出来。通过构建系统发生树，能确定各种病毒之间的关系，得出病毒到底是由人类传染给动物，还是由动物传染给人类的。本文借助构建BDV系统发生树的方法，得出宁夏牛脑组织BDVp24基因与德国He/80株形成了德国－宁夏的混合支系，且其基因的序列和同源性都很高，因此，推断宁夏地区牛脑组织中p24序列与德国马源性的He/80株有极高的同源性，为进一步了解 BDV的性质提供了信息，具有一定的参考价值。

 

　　参考文献： 

  　　　［1］Kathrvn M,Carbone. Borna Disease Virus and Human Disease［J］. Clin Microbiol Rev,2001,14(3):513-527.

　　　　［2］马培林,张凤民,李桂梅,等.博尔纳病病毒自然感染状况及其核苷酸序列［J］.中国公共卫生,2004,20（4）:408-410.

　　　　［3］王振海,谢鹏,韩玉霞,等.宁夏及其周边地区博尔纳病病毒感染的分子流行病学研究［J］.中华流行病学杂志,2006,27(6):479-482.

　　　　［4］赵立波,谢鹏,牟君,等.重庆市山羊博尔纳病病毒P24基因的检测［J］.中国兽医科学,2006,36（06）:460-463.

　　　　［5］马彦,王振海,孔繁元,等.博尔纳病病毒感染与病毒性脑炎发病的关系［J］.中华流行病学杂志,2009,12（30）:1284-1287.

　　　　［6］王振海,谢鹏,杨平,等.病毒性脑炎患者血液和脑脊液博尔纳病病毒p24的检测［J］.中华神经科杂志,2006,39（2）:105-108.

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　　　　［7］Stitz. Dietzchold, K.M.Carbone, et al. Immunopathogenesis of Borna disease［J］.Curr Top Microbiol Immunol,1995,190:75-92.