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    【摘要】　目的 研究电刺激左右侧迷走神经对感染性休克大鼠肝脏炎性反应的影响。方法 采用盲肠结扎穿孔法(CLP)复制感染性休克模型。40只SPF级健康雄性SD大鼠，随机分为5组，每组8只。①假CLP组；②CLP组；③迷切组；④电刺激左侧迷走神经组；⑤电刺激右侧迷走神经组。刺激方法是分别将左、右侧迷走神经远端连接刺激电极，于CLP术毕即刻持续电刺激(5 V、2 ms和1 Hz) 20 min。各组动物均行颈总动脉置管连续监测平均动脉压，用ELISA法检测肝脏匀浆肿瘤坏死因子α(TNF?α)及血清乙酰基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)的含量。结果 CLP术后平均动脉血压进行性下降，肝脏匀浆TNF?α水平含量显著升高(各P<0.01)；与CLP组比较，电刺激左、右侧组动物平均动脉压下降幅度减轻，肝脏匀浆TNF?α含量显著降低(各P<0.01)；电刺激左、右侧组无明显差异。结论 电刺激左、右侧组迷走神经能缓解CLP致感染性休克大鼠的进行性血压下降，降低肝脏匀浆TNF?α及血清AST、ALT含量，对肝功能有潜在的保护作用；电刺激左、右侧组迷走神经之间肝脏匀浆TNF?α及血清AST、ALT含量无明显差异。

　　【关键词】 迷走神经；电刺激；感染性休克；肿瘤坏死因子

　　　近年对胆碱能抗炎通路的研究表明：神经系统和免疫系统之间存在着一条由迷走神经及其释放的递质乙酰胆碱为主构成的抗炎通路。该通路激活后可能对预防和拮抗感染性休克发病进程中过度的全身性炎性反应有重要作用〔1～3〕。为了避免心脏方面的副作用，电刺激常选择左侧迷走神经刺激术（左侧迷走神经支配房室结功能，右侧支配窦房结功能），而电刺激右侧迷走神经却少见报道。但左、右侧迷走神经的解剖路径有所不同，两侧迷走神经兴奋对胆碱能抗炎通路的激活效应是否有所差异，对其可行性及其机制的阐明有助于未来胆碱能抗炎通路激活抗炎效应在临床的应用。本研究采用盲肠结扎穿孔法(cecal ligation and puncture，CLP)复制大鼠感染性休克模型，观察电刺激左、右两侧迷走神经时感染性休克大鼠一般情况、血压、肝脏匀浆肿瘤坏死因子 α(TNF?α)和血清乙酰基转移酶（AST）、血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平变化情况，探讨左、右迷走神经分别兴奋对大鼠肝脏炎性反应的影响，进一步阐明胆碱能抗炎通路的作用机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物及分组

　　40只无特定病原体（SPF）级健康雄性SD大鼠(甘肃中医学院动物实验中心提供),体重200～250 g。动物合格证号：医动字FCXK（甘）2004?2006。随机分为5组,每组8只。①假CLP组：行假CLP术+双颈部迷走神经干分离术；②CLP 组：行CLP术+双颈部迷走神经干分离术；③迷切组：行CLP术+双颈部迷走神经干离断术；④电刺激左侧迷走神经组：行CLP术+双颈部迷走神经干离断术+左侧迷走神经干远端电刺激；⑤电刺激右侧迷走神经组：行CLP术+双颈部迷走神经干离断术+右侧迷走神经干远端电刺激。

　　1.2  CLP模型制作

　　乌拉坦(1 g/kg)腹腔注射麻醉后，分离颈总动脉及迷走神经；行颈总动脉置管，连接压力传导系统和监护仪连续监测直接动脉压。于前腹正中作长约2～3 cm切口，游离肠系膜和盲肠，以3.0丝线环行结扎盲肠根部，用9号针头于盲端部位穿刺2处，两针孔相距约3 mm，还纳肠管，逐层缝合关腹。术毕皮下注射生理盐水(30 ml/kg)补充体液丢失，碘伏消毒并包扎伤口。假CLP组除不结扎和穿刺盲肠外，其余步骤相同。

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　　1.3  迷走神经离断术和电刺激

　　麻醉后，动物仰卧位固定备皮，在喉头与胸骨之间沿颈腹正中线做长约2.5～4 cm切口，用止血钳将胸骨舌骨肌与胸骨甲状肌分开，即可找到颈动脉鞘(内有颈动脉及颈部神经)。用左手拇指及食指抓住颈皮及颈肌，以中指顶起外翻，右手持止血钳或玻璃分针顺着血管走向钝性分离颈总动脉和迷走神经约3～4 cm，用4.0丝线结扎迷走神经然后剪断，远端与双铂电极连接。CLP术后即刻以5 V、2 ms和1 Hz强度的电能，持续刺激迷走神经远端20 min。

　　1.4  主要试剂及仪器

　　主要试剂有大鼠TNF?α ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程研究所提供，批号：EK0526)、一氧化氮合酶（NOS）、一氧化氮（NO）检测试剂盒(南京建成生物工程研究所提供，批号：20070918和20070919)主要检测仪器有UV?2300上海天美紫外分光光度计、GZ?16湘仪台式高速低温离心机和超低温冰箱 (日本SANYO)。

　　1.5  观察指标及样本采集

　　1.5.1  一般情况及血流动力学监测

　　CLP术后观察动物有无萎靡、寒颤、竖毛、腹泻、脓尿及眼角分泌物增加等表现。颈总动脉置管连续监测平均动脉血压，右颈总动脉插管，经三通管与压力变换器连接，输入台式电脑由BL?420生理仪分析系统（成都泰盟）记录血压波形变化和数值。

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　　1.5.2  肝脏匀浆TNF?α及血清AST、ALT的测定

　　电刺激后处死大鼠，称取大鼠肝组织在冰浴中匀浆，离心(3 000 r/min,4℃)15 min后，取上清保存于?70℃。用ELISA法检测肝脏匀浆TNFα含量，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。血清AST及ALT检测由专人负责。

　　1.6  统计学分析

　　用SPSS11.5软件处理数据，数据以x±s表示，采用ANOVA方法。

　　2  结果

　　2.1  电刺激迷走神经对感染性休克大鼠平均动脉压的影响

　　假CLP组大鼠在实验过程中血压平稳。CLP组的平均动脉压在1 h内开始下降，并持续2 h。电刺激左侧迷走神经＋CLP组和电刺激右侧迷走神经＋CLP组在2 h内都能有效维持，并明显优于CLP组(P＜0.01),见表1。表1  各组大鼠平均动脉压的变化(略)

　　2.2  电刺激迷走神经对各组大鼠肝脏匀浆TNF、血清AST、ALT的影响

　　CLP组大鼠休克后2h时的大鼠肝脏匀浆TNF?α、血清AST、血清ALT水平明显升高(P＜0.01),迷走神经切断后，肝脏匀浆 TNF?α含量、血清AST、血清ALT水平升高更为明显,与假CLP组比较均有显著性差别。电刺激左、右迷走神经后2 h时TNF?α含量值、血清AST、血清ALT水平显著低于CLP组(P＜0.05),而与假CLP组含量相近,见表2。表2  各组大鼠肝脏匀浆TNF?α及血清AST、ALT的影响(略)

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　　3  讨论

　　肝脏既是清除内毒素的场所，同时又是内毒素血症、感染性休克过程中最易受损的器官之一。感染性休克时，库普弗细胞和肝内单核细胞释放促炎介质，包括TNF?α等介导肝脏损害〔4〕。其中TNF?α被视为LPS所致肝脏病理生理过程的关键性促炎介质。TNF?α生成后其本身又可刺激单核/巨噬细胞生成一系列介质而诱发炎症并最终导致全身性炎性反应综合征〔5〕。另外，TNF?α还可刺激内源性血管收缩剂的释放，是导致感染性休克时血流动力学改变的重要原因。因此，早期有效清除循环TNF?α，有助于改善感染性休克早期的血流动力学，并减轻炎症〔6〕。迷走神经是由运动性和感觉性神经纤维所组成的一个混合性神经，其中肝脏接受来自腹腔神经丛的迷走神经支配。迷走神经一般被分为

　　前丛和后丛，前丛由左右腹腔神经节和左迷走神经分支组成，包括胆囊管、胆囊和胰腺?胆总管分支，其在肝动脉周围形成鞘，并沿肝动脉进入肝脏。后丛由右腹腔神经节和右迷走神经分支组成，主要沿肝外胆管和门静脉分布，其有分支与前丛神经分支相沟通〔7〕。大鼠肝的迷走神经支配则主要是通过迷走神经在贲门上几毫米处发出的肝支直接支配，而不是通过腹腔神经丛〔8〕。众多的研究〔9～11〕发现，直接电刺激内毒素休克大鼠的左侧迷走神经传出纤维，可降低血清及肝中TNF?α发现，直接电刺激内毒素休克大鼠的左侧迷走神经传出纤维，可降低血清及肝中TNF?α的含量，使休克动物的低血压得到缓解。

　　本试验结果显示，大鼠遭受CLP术后，平均动脉压进行性下降，肝脏匀浆TNF?α显著升高。而电刺激迷走神经使其兴奋后，平均动脉压下降趋势减缓，肝脏匀浆TNF?α含量显著降低，电刺激左、右两侧迷走神经组血清AST及ALT的含量显著低于CLP组，表明电刺激迷走神经可降低肝脏TNF?α水平，并具有保护肝功能的作用。而且电刺激左、右两侧迷走神经之间，肝脏组织匀浆TNF?α含量及血清AST、ALT的水平无显著性差异。研究认为电刺激左侧迷走神经后释放大量乙酰胆碱，与存在于库普弗细胞和肝内单核细胞上的乙酰胆碱受体α7亚单位结合〔12〕，通过一系列途径阻止库普弗细胞和肝内单核细胞释放TNF?α，从而拮抗肝脏组织乃至全身的炎性反应。尽管左右侧迷走神经解剖路径不同，本试验的结果表明左右两侧迷走神经兴奋后都可拮抗肝脏组织的炎性反应，其作用可能均通过胆碱能抗炎通路发挥作用。电刺激大鼠右侧迷走神经只要控制给予恰当的刺激参数，同样可以用于胆碱能抗炎通路的研究；对于左右侧迷走神经兴奋对肝脏库普弗细胞的支配以及细胞内信号的传导有否差异有待下一步研究阐明。

 

　　参考文献： 

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　　2 Pavlov VA,Tracey KJ.Controlling inflammation:the cholinergic anti?inflammatory pathway〔J〕.Biochem Soc　Trans,2006;34(6):1037?40.

　　3 姜小国,胡森,石德光，等.迷走神经兴奋对内毒素血症大鼠肝脏氧自由基及TNF?α的影响〔J〕.中国现代医学杂志，2003；13(20):35?8.

　　4 Chaudry IH.Sepsis lessons learned in the last century and future directions〔J〕.Arch Surg，1999;134(9):922?9.

　　5 Adamson GM，Billings RE.Tumor necrosis factor induced oxidative stress in isolated mouse hepatocytes〔J〕.Arch Biochem Biophys，1992；294(1):223?9.

　　6 Gross SS,Wolin MS.Nitric oxide:pathophysiological mechanisms〔J〕. Annu Rev Physiol,2005；57：737?69.

　　7 陈明易，李崇辉，黄志强.肝脏支配神经及其对肝脏循环的调节〔J〕.国外医学·外科学分册，2003；30（5）：280?2.

　　8 Shimazu T.Progress and perspective in neurohepatology.In:Shimazu T.Liver innervation〔M〕.John Libbey,1996:57.

　　9 胡正芳,李建国,杜朝晖,等.电刺激迷走神经对感染性休克大鼠肝脏炎性反应的影响〔J〕.武汉大学学报(医学版),2004；25（4）:368?71.

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　　10 Tracey KJ.The inflammatory reflex〔J〕.Nature,2002;420(6917):853?9.

　　11 郑崇明,徐鑫荣,王勇,等.迷走神经电刺激对内毒素致兔肝脏损害的作用〔J〕.南京医科大学学报，2004；18（3）:137?40.

　　12 Wang H,Yu M,Ochant M,et al.Nicotinic acetylcholine receptorα7 subunit is an essential regulator of inflammation〔J〕.Nature,2003；421(6921):384?8.