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　　     【摘要】 目的 研究白血病细胞株HL-60中基质金属蛋白酶2、9(MMP-2、MMP-9)和基质金属蛋白酶天然抑制剂-1(TIMP-1)的表达及细胞因子干扰素 (IFN-γ)对MMP-2、MMP-9和TIMP-1转录水平的调节。方法 分别在HL-60细胞生长的不同时期(1-5d)收集细胞，采用半定量RT-PCR方法，分析白血病细胞株HL-60中MMP-2、MMP-9和 TIMP-1 mRNA的表达水平；以不同浓度的IFN-γ作用于HL-60细胞，24、48 h后RT-PCR检测MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA水平的变化。结果 细胞接种后24 h MMP-2和MMP-9的mRNA水平最高，但TIMP-1表达相对恒定。IFN-γ各个浓度组对MMP-2和MMP-9 mRNA表达均有抑制作用(P<0.05)，且随着作用浓度的增高mRNA表达减少；TIMP-1对其调节不敏感。结论 明确了白血病HL-60细胞株在转录水平表达MMP-2、MMP-9和TIMP-1；IFN-γ对MMP-2、MMP-9 mRNA表达有明显的抑制作用，而对TIMP-1转录无明显作用。

　　　　【关键词】 基质金属蛋白酶；基质金属蛋白酶抑制剂；白血病；干扰素-γ  

　　　基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)是一类结构上具有极大同源性、活性依赖于锌离子和钙离子的蛋白水解酶，主要生理功能是降解细胞外基质(extracellular matrix, ECM)成分。对MMP在实体瘤中的作用研究表明，MMP不但介导肿瘤细胞对宿主包括基底膜在内的ECM的降解，影响肿瘤的侵袭和转移，还调控肿瘤新生血管的形成，影响细胞黏附分子的功能以及调控肿瘤细胞的生长［1-2］。白血病的浸润过程是多基因、多步骤、多阶段相互作用的级联反应，其中MMP介导的 ECM及基底膜的降解过程是肿瘤侵袭、转移的一个关键步骤。MMP-2和MMP-9是此过程的关键因子。MMP活性又受到其天然抑制剂的调节［3］。研究发现，MMP、基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase, TIMP)和微环境中的细胞因子三者之间相互调节，构成一个交叉网络而发挥其功能。许多细胞因子对MMP-2和MMP-9有调节作用。为了进一步了解白血病的浸润和转移机制，寻求白血病治疗的新靶点，我们采用细胞培养和RT-PCR等方法，观察了MMP-2、MMP-9和TIMP-1基因在白血病细胞中的表达情况，旨在探讨MMP-2、9在白血病发病机制中的作用，以及细胞因子IFN-γ对其表达的影响。如何快速发表论文

　　1  材料与方法

　　1.1  细胞株的培养及分组

　　急性髓系白血病细胞株HL-60由西安交通大学医学院第一附属医院分子中心实验室惠赠。细胞培养液由RPMI-1640培养液、100 mL/L灭活小牛血清及100 u/mL的青、链霉素组成。HL-60细胞置于37 ℃、50mL/L CO2饱和湿度的培养箱中悬浮培养，2-3 d换液一次，实验用细胞处于对数生长期。将HL-60细胞以5×104细胞/mL接种于培养瓶中，分别在细胞生长的不同时期(1-5 d)收集细胞，用于RT-PCR。IFN-γ对MMP-2、MMP-9和TIMP-1转录水平的调节实验中，将细胞分为空白对照组(不加IFN-γ)及 IFN-γ 10、50、100、200、500 u/mL组。

　　1.2  药物、试剂及设备

　　IFN-γ纯度99%(晶美生物公司)；RPMI-1640培养基(GIBCO公司)；新生牛血清、胎牛血清(民海生物工程有限公司)；DEPC(Sigma公司)；Trizol Reagent(Invitrogen公司)；反转录试剂盒(Fermentas公司)；2×PCR Taq Mix(广州东盛生物科技有限公司)。CO2孵箱(National Appliance Company)；GeneAmp PCR System 2400(PERKIN ELMER, USA)；紫外透射反射检测分析仪(上海复生生物工程研究所)。如何快速发表论文

　　1.3  RT-PCR法检测MMP-2、MMP-9和TIMP-1的表达

　　1.3.1  细胞内总RNA的提取

　　所用试剂、器具、试管均经去Rnase处理，所有实验器具、试管、橡胶和塑料均用DEPC浸泡过夜后高压消毒。取各实验组细胞(每组细胞数为 4×105)离心弃上清后，加入TRIZOL 1 mL反复吹吸至细胞完全溶解，加入氯仿孵育离心后取无色的水相上层，加入异丙醇孵育离心后，取底部胶样团块即为沉淀的RNA。乙醇洗涤、干燥后，溶解于 DEPC处理过的三蒸水中，储存于-70 ℃。紫外分光光度仪测量RNA的浓度A260/280的比值；10 g/L琼脂糖凝胶电泳(200 V，30 min)，检查18 S和28 S带的存在。如何快速发表论文

　　1.3.2  cDNA的制备

　　无核酶的Eppendorff管中加入Oligo(dT)16 1 μL和RNA 1 μg，70 ℃加热后冰上迅速冷却，经短暂离心后，再分别加入5×Reactive Buffer 4 μL、10 mmol/L dNTP mixture 1 μL、RibolockTM Ribonuclease inhibitor 1 μL，70 ℃加热后冰冻、离心，加入1 μL MMLV(逆转录酶，200单位)，42 ℃孵育60 min，然后70 ℃下加热10 min灭活反应。将转录的cDNA储存于-20 ℃，2周内进行PCR反应。

　　1.3.3  引物设计与合成

　　PCR引物由引物设计软件Priemier primer设计合成，并经由blast进行同源性分析(上海Sangon公司合成)。MMP-2：上游5′-TGACGGTAAGGACGGACTC- 3′，下游5′-TGGAAGGGAATGGAAAC-3′，扩增片段长度为324 bp；TIMP-1：上游5′-TTCCACAGGTCCCACAAC-3′，下游5′-GCATTCCTCACAGCCAAC-3′，扩增片段长度为 165 bp；MMP-9：上游5′-TCCCTGGAGACCTGAGAACC-3′，下游5′-CGGCAAGTCTTCCGAGTAGTT-3′，扩增片段长度为308 bp；β-actin：上游5′-ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3′，下游5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′，扩增片段长度为621 bp。如何快速发表论文

　　1.3.4  PCR反应

　　2×PCR Taq Mix(100 mmol/L KCl、20 mmol/L Tris-HCl、3 mmol/L MgCl2、0.2 g/L明胶)12.5 L，Primer 1(10 μmol/L) 1 μL，Primer 2(10 μmol/L) 1 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O加至总体积25 μL。分别按不同条件扩增目的基因片段：MMP-2循环参数为94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环；MMP-9循环参数为94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环；TIMP-1循环参数为94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环；β-actin循环参数为94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环。以未经逆转录的总RNA作为阴性对照。

　　1.3.5  PCR产物的检测和分析

　　取PCR产物在20 g/L的琼脂糖凝胶中电泳，电压恒定为75 V，电流约为30 mA。Genesnap软件对凝胶电泳条带照相，用图像分析仪(Image Master)扫描，Genetools软件行灰度值分析，以目的条带与内参条带的吸光度体积的比值(MMP-2/β-actin、MMP-9/β- actin、TIMP-1/β-actin)代表目的基因mRNA的相对水平。

　　1.4  统计学处理

　　实验共重复3次，每次各种作用浓度的细胞3瓶。实验结果以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用Dunnett-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  HL-60细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA的表达 如何快速发表论文

　　HL-60细胞表达MMP-2、MMP-9，细胞接种后24h MMP-2和MMP-9的mRNA水平最高。HL-60细胞在第2天进入对数生长期，生长状态良好。细胞表达相对恒定的TIMP-1(图1)。

　　图1  MMP-2、-9和TIMP-1在HL-60细胞中的表达

　　Fig.1 Expression of MMP-2, 9 and TIMP-1 in HL-60 cell line at various time2.2  IFN-γ对HL-60细胞MMP-2、MMP-9 和TIMP-1表达的调节作用  空白对照组(不加IFN-γ)及IFN-γ 10、50、100、200、500 u/mL组，作用24、48 h后收获细胞。RT-PCR检测药物作用的各组细胞MMP-2、9的基因表达均较空白对照下降(图2、图3)，而作用各组间TIMP-1基因表达无明显变化(图4)。统计学分析结果显示，IFN-γ各个浓度组均对MMP-2、MMP-9 mRNA有抑制作用(P<0.05)，且随IFN-γ作用浓度的增高而mRNA表达逐渐减少，即表现为对剂量的依赖关系，而TIMP-1表达恒定，IFN-γ对其的调节不明显(表1)。表1  IFN-γ对HL-60细胞中MMP-2、-9和TIMP-1的表达的影响（略）

　　3  讨论

　　白血病作为一种造血系统的恶性克隆性疾病，在其发生、发展的过程中与骨髓微环境的变化有很大关系。MMP是骨髓微环境中不可或缺的组成部分，其家族成员能够降解EMC的所有组成成分［4］。MMP-2和MMP-9 属于MMP家族的Ⅳ型胶原酶，以酶原形式分泌，作用底物主要为Ⅳ型胶原和变性的明胶，其表达和活性受其内源性抑制剂TIMP的影响，二者活性平衡对于维持细胞外基质的稳定至关重要［4］。有研究表明，NHL细胞的高侵袭性和转移性与细胞表达MMP-2、MMP-9、降解EMC和基底膜、协助瘤细胞向原发部位基质外扩散有关［5］。国内研究发现，MMP-2和MMP-9水平可反映多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)患者的肿瘤负荷，其升高与血管新生和MM病情进展及肿瘤浸润等病理过程有关［6-7］。而骨髓微环境中发生的MMP与ECM相互作用的紊乱，不仅抑制了造血干/祖细胞的分化成熟，而且使原始及幼稚细胞提前从骨髓中释出，加速了白血病的发展。Kuittinen等［8］认为MMP-2的表达对急性髓系白血病的预后有良好的相关性。这说明，在急性髓性白血病的发生、发展过程中，MMP-2和MMP-9发挥着重要作用。因此，了解MMP-2和MMP-9在白血病的作用机制及对其表达或活性作用的调控显得十分重要。为此，我们用RT-PCR的方法，从基因水平检测了在急性髓性白血病细胞株HL-60细胞中 MMP-2、MMP-9的表达变化。结果显示，HL-60细胞可以表达MMP-2和MMP-9，并且在细胞接种24 h二者表达水平最高，说明二者在白血病的发生、发展中有一定的作用。

　　此外，我们试图找出对MMP-2、MMP-9表达及其活性有调控作用的因素，以期可以抑制其表达活性。已有研究表明，除可溶性因子以外，细胞外基质与细胞之间、黏附分子介导的细胞与细胞之间的相互作用也对 MMP的基因表达有明显的调控作用。杨琳等［9］研究表明，血管内皮生长因子可上调AML患者MMP的表达，共同参与白血病髓外浸润的发生。但目前的研究大多是针对MMP的转录激活方面的，而对MMP的负调控因子的研究相对较少。干扰素是病毒感染细胞分泌的抗病毒功能蛋白，其中IFN-γ具有比较突出的细胞生长抑制作用。王苹等［9］研究发现，IFN-γ可以明显抑制Hep-2喉癌细胞的MMP-2、MMP-9 mRNA的表达，降低肿瘤细胞的侵袭性。Galboiz等［11］研究发现IFN-γ可下调多发性硬化症患者的单核细胞MMP-2、TIMP-2、 MT1-MMP的表达。本研究结果显示，实验范围内不同浓度的IFN-γ均可显著降低HL-60细胞中MMP-2、MMP-9 mRNAs的表达(P<0.05)，且随着IFN-γ浓度增高，mRNA表达量逐渐减少，即表现为对剂量的依赖关系。这与IFN-γ在其他肿瘤中对 MMP-2和MMP-9转录水平的抑制作用相同。Ma等［12］证实IFN-γ可以抑制MMP-9表达，该抑制效应是由削弱转录引起的，可能是STAT- 1α途径依赖的过程，调节局部浸润的单核细胞合成MMP。但也有研究显示，IFN-γ对单核细胞MMP表达的调节非常复杂，在不同的细胞因子环境下 IFN-γ对单核细胞产生MMP的作用不同。比如当与GM-CSF联合使用时，IFN-γ通过刺激TNF-α的产生而引起MMP-1的表达；而通过活化 caspase8由p38-STAT1途径介导，IFN-γ可抑制TNF-α引起的MMP-9合成［13］。

　　为了更进一步分析IFN-γ对MMP-2、MMP-9抑制作用的可能机制，实验还对白血病细胞株HL-60中TIMP-1的表达以及IFN-γ对其调节作用进行了研究。 TIMP是MMP的天然组织抑制物，既可以在MMP酶原激活的阶段抑制MMP的激活，也可在激活后抑制MMP的活性。其中TIMP-1是MMP-9相关的生理性抑制因子。实验结果显示，细胞内TIMP-1 mRNA的表达水平相对恒定，且各种浓度的IFN-γ对其表达的调控作用不明显。因此，我们推测IFN-γ对HL-60细胞MMP-9的抑制作用可能是对基因本身转录的直接抑制作用，而非间接通过抑制TIMP-1的表达使MMP-9 mRNA的表达量降低。

　　本实验证实了白血病细胞株HL-60可以表达MMP-2和MMP-9，且IFN-γ对其表达活性有抑制作用。由于MMP-2和MMP-9在白血病的浸润、进展中起着非常重要的作用，并对白血病预后也有重要意义，因此，本实验可能为白血病的治疗提供了一个新的重要靶点，并为今后临床的深入研究奠定了初步的实验基础。目前，以MMP-2和MMP-9为靶标的抑制剂正用于肿瘤转移模型及人类癌症的临床研究，在确定TIMP用于肿瘤治疗之前，还有许多基础工作有待完成。目前已有一些人工合成的TIMP，如marimastat、BMS-275291、 AE-941(neovastat)和COL-3(metastat)，已应用于III期临床试验［14-15］，但效果还不是十分理想，考虑可能是 MMP在体内的作用机制十分复杂，尚需要进一步研究。

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