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γ-氨基丁酸A受体在大鼠急性脑缺血中的变化

时间:2018-10-29 15:37 文章来源:http://www.lunwenbuluo.com 作者:孙智敏 , 张茂林 , 点击次数:

    【摘要】  目的:观察大鼠大脑皮质γ-氨基丁酸A受体(γ-aminobutyric acid A receptors,GABAAR)在脑缺血不同时段的表达及其动态变化的规律,探讨其在急性脑缺血中变化的意义。方法:65只雄性Wistar大鼠随机分为对照组,脑缺血6 h组、12 h组、24 h组、3 d组、7 d组、14 d组(均为手术组),假手术组;采用大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,至规定时间点取大脑组织,行HE染色,用光学显微镜观察神经元损伤程度;用免疫组织化学技术判断神经元阳性表达的强弱;用形态分析系统检测各组GABAAR表达的阳性细胞数。结果:各手术组GABAAR表达均低于假手术组及对照组,与对照组相比,缺血6 h其表达既有降低,至12 h降至最低。而假手术组与对照组相比无统计学意义。结论:急性脑缺血可引起GABAAR表达下调,致使其对兴奋性氨基酸毒性的抑制作用减弱,这种下调和减弱程度与脑缺血的严重程度相一致,提示GABAAR在缺血性脑损伤中有神经保护作用,可能减缓了缺血性脑血管病的进程,同时GABAAR作为脑内最主要的一种抑制性氨基酸神经递质受体,除通过其配体门控性Cl-通道介导的效应对抗“兴奋毒性”作用外,GABAAR本身也因缺血所致理化因素的改变而发生变化。
  【关键词】  脑缺血;γ-氨基丁酸A受体;大鼠
 
   脑缺血时,由于各类氨基酸大量释放,兴奋性氨基(exicitatoryamino acids,EAA)与抑制性氨基酸(inhibitory amino acids,IAA)间平衡被破坏,是导致神经元急性和迟发性“兴奋性毒性”损伤的关键因素。GABAA受体(GABAAR)作为脑内最主要的一种抑制性氨基酸神经递质受体,除通过其配体门控性Cl-通道介导的效应,对抗兴奋性氨基酸的兴奋性毒作用外,GABAAR本身也因缺血所致理化因素的改变而发生变化。
  为了研究GABAA受体在脑缺血中的作用机制,我们在MCAO模型基础上,动态研究GABAAR在缺血性脑血管病中表达的变化,期待从分子水平揭示GABAAR在脑缺血中的作用机制。
  1 材料与方法
  1.1 实验动物及材料 健康Wistar雄性大鼠65只,体重260~310 g,由内蒙古大学动物试验中心提供。鼠抗兔GABAAR多克隆抗体购于美国麦莎公司;即用型SABC免疫组化染色试剂盒、抗体稀释液、DAB显色试剂盒、 PBS缓冲液、枸橼酸盐缓冲液、中性树胶均购于武汉博士德公司。
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  1.2 实验方法
  1.2.1 动物分组 将动物随机分为正常对照组(NC),脑缺血后6 h组、12 h组、24 h组、3 d组、7 d组、14 d组(手术组,IG)及相对应时间点的假手术对照组(SOC),每组5只,共65只。
  1.2.2 动物模型制备 采用右侧大脑中动脉线栓法(MCAO),大鼠用10 %水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉,取仰卧位固定于鼠台,碘伏消毒后颈部正中切口,暴露右颈总动脉和颈内、外动脉,结扎颈总动脉和颈外动脉近心端,血管夹夹闭颈内动脉,在近颈总动脉分叉处留置一条结扎线以便插线后固定鱼线。在颈总动脉近分叉处剪一约0.3 mm小口,将头部蘸有石蜡的鱼线(线直径0.26 mm,长50 mm)经小口处插入,沿颈内动脉入颅,进线深度由分叉处算约20 mm,稍感阻力时停止,此时已至大脑中动脉起始处,结扎用以固定鱼线的结扎线,剪去多余的栓线,缝合手术切口。假手术组除不插鱼线外,其余步骤同缺血组。
  1.2.3 组织切片制备 分别在上述规定时间点,给予大鼠10 %水合氯醛0.5 mL腹腔注射麻醉,剪开胸腔经左心室快速输入0.9 %氯化钠注射液,同时剪开右心耳,待血色变淡后快速输入4 %多聚甲醛磷酸缓冲液固定脑组织,待鼠颈及四肢僵硬后停止灌注,快速断头取脑,自额极至枕叶分A、B、C、D、E 5等分,取C等分置于4 ℃ 4 %多聚甲醛磷酸缓冲液固定保存24 h,常规脱水、浸蜡、包埋,制成5 μm厚冠状切片。
  1.2.4 光镜观察 取各组大鼠脑组织切片,经HE染色后,用光学显微镜观察神经元损伤程度;用免疫组织化学技术判断神经元阳性表达的强弱;用形态分析系统检测各组GABAAR表达的阳性细胞数。
  1.2.5 免疫组化法检测 GABAAR采用链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法染色(SABC法)。如何发表论文
  1.3 图像分析 采用江苏省捷达科技公司的形态分析系统进行图像分析,每张切片随机选出10个单位面积,测量免疫组化染色的阳性细胞数。
  1.4 统计学分析 采用SPSS 10.0统计软件,各组数据均以均数±标准差(x±s)表示,两组间数据比较采用t检验,并进行方差齐性检验,P<0.05为差异有统计学意义。
  2 结果
  2.1 神经细胞病理形态学改变 光镜观察对照组、假手术组神经细胞形态结构正常、核圆淡染、核仁明显,未见组织坏死,见图1;手术组缺血灶内可见血管和神经元周围胶质成分肿胀,神经元呈三角形或杆状,胞核偏位并深染,有的甚至裂解、消失,见图2;脑缺血时间越长,细胞变化越明显,缺血重的组织内甚至可见液化性坏死灶,灶内神经元残存较少甚至缺失。
  2.2 免疫组化结果 免疫组化阳性细胞信号呈棕黄色,在正常组织内GABAAR主要位于细胞膜和胞浆内,见图3;缺血后大脑皮质内 GABAAR阳性神经元显著减少,有些神经元胞浆内着色亦变淡,见图4。与相应时间点HE染色结果比较,发现GABAAR阳性神经细胞减少以缺血灶及其周围部位最为显著,在一些缺血严重的神经组织内看不到阳性神经元。另外,可见缺血灶内胶质成分呈颗粒状,背景染色较对照组浅。
  与对照组相比,各时间点假手术对照组神经元阳性细胞数均无明显改变(P>0.05);与假手术组相比较,缺血组神经元阳性细胞数于脑缺血后6 h即有降低,12 h降至最低,故GABAAR表达于脑缺血后6 h即有明显降低(P<0.05),12 h降至最低。见表1。表1 各组GABAAR阳性细胞数的变化
  3 讨论
  GABAAR是中枢神经系统内主要的抑制性受体,参与了CNS的许多病理生理过程,但目前的研究并不深入。GABAAR功能障碍与多种神经和精神疾病,如脑缺血、癫痫、焦虑、抑郁、疼痛、老年痴呆等有关[1]。巴比妥类和苯二氮卓类(BZ)等药物作用于GABAAR能发挥其镇静、催眠、抗惊厥等药理作用[2]。
  目前关于GABAAR在缺血性脑血管病病中的作用尚无定论。有资料报道GABAAR在缺血性脑损伤中表达下调,认为其发挥了保护作用;另一些则报道GABA受体的阻断剂具有部分神经保护作用,这表明抑制性递质受体的活动导致兴奋性毒性[3]。GABA受体是通过与GABA结合来实现中枢抑制作用,GABA可阻断Glu兴奋性毒性,抑制细胞膜去极化和Ca离子内流,具有神经保护作用[4-5]。在以往动物试验中,在卒中急性期应用γ-氨基丁酸类物质可减小卒中灶的体积而起到脑保护作用[6-7]。γ-氨基丁酸也参与了神经元损伤[8],并且与兴奋性氨基酸的兴奋毒性相关。二者比例的失衡可导致细胞功能持久或不可逆的改变。
  1983年由Sigel等首次提纯并测定GABAAR序列后,目前通过cDNA克隆技术已鉴定了哺乳动物大脑中的18个GABAAR亚基,依据其氨基酸序列的相似程度,将亚基系列分为8个亚基族,分别命名为α1-6、β1-4、γ1-4、ρ1-3、δ、ε、π和θ[9],其中γ2又有两种异构体,即长型γ2L和短型γ2S,从而构成GABAAR复合物的多样性和生理、药理特性的复杂性[10]。如何发表论文
  目前的大量研究已表明GABAAR介导的生物效应在脑缺血性损伤的保护作用中起着重大作用。GABAAR是由膜蛋白组成的五聚体,由5个亚单位组成,这些膜蛋白控制GABA门控氯离子通道[11]。GABA作用于GABAAR上GABA位点,使神经细胞膜的氯离子通透性增加,由于细胞外氯离子浓度比细胞内氯离子浓度高,氯离子顺浓度梯度差进入细胞内,细胞内膜电位增大而产生超极化,从而介导了突触后膜抑制性突触后电位(inhibitory postsynaptic potential,IPSP)的产生,对谷氨酸等兴奋性氨基酸的“兴奋性毒性”作用具有直接的对抗作用。
  我们在大鼠MCAO模型的基础上,揭示了脑缺血自然病程中GABAAR的变化过程。伤后不同时间脑切片HE染色对照表明,GABAAR弱阳性神经元多为缺血较重的神经元。提示在缺血性脑血管病的自然病程中,GABAAR参与了缺血性脑损伤的过程。我们的研究表明,正常组与各假手术组无差异,说明单纯的手术操作对GABAAR的表达无明显影响。 GABAAR在脑缺血后逐渐下降,缺血再灌注6 h后开始持续下调,12 h最为显著,这也说明GABAAR在继发性神经元损伤中可能发挥着重要的作用。结合以前的研究结果,即血液和脑脊液中的GABA在缺血性脑血管病中呈先升高后降低的双相变化,在缺血后GABA明显增高,再灌注后降低。Shimada等[11]报道再灌注早期GABA水平的升高可能是一种“保护性”反应,但有不少实验表明这种GABA增加可能导致GABA受体质量改变,引起其抑制效应衰减或兴奋性氨基酸释放,因而这种早期反应性增加仍不能对抗大脑皮质缺血性损伤。我们推测脑缺血时GABAAR数量出现的改变,可能与脑缺血损伤时细胞外液中GABA大量堆积,负反馈调控机体GABAAR表达的缘故,也可能是由于受体内移造成的。此外,尚有研究证实[12],选择性NMDA受体激动剂或拮抗剂也可调节GABAAR功能和亚单位的表达,因而推测脑缺血时细胞外液中高浓度的谷氨酸激动NMDA受体可能也参与GABAAR结构的变化[12]。至于迟发性GABAAR密度和分布的变化,则可能与脑缺血时神经元的降解有关。但目前我们没有足够的证据。若从上述GABAAR的改变机理来看,我们对谷氨酸兴奋性毒性的抑制除了集中在怎样去灭活生成过多的Glu及其生成途径上之外,还应关注在缺血再灌注损伤中GABA受体结构和功能的变化。特别是在目前各种氧自由基清除剂、谷氨酸受体阻滞剂和钙离子拮抗剂尚未取得较好临床疗效的前提下,开发和利用拟GABA类药物以及促进或恢复GABAAR功能的药物,对抗兴奋性氨基酸的兴奋毒性,可望成为一种抗脑缺血性损伤的新途径。
    参考文献: 
    [1] 立志,徐进宜,吴晓明,等.γ-氨基丁酸受体及相关药物研究进展[J].中国医疗前沿2007,2(4):2-8.
  [2] Erdo SL.Strychnine protection against excitotoxic cell death in primary cultures of rat cerebral cortex[J].Neurosci Let,1990,115:340-344.
  [3] Nelson RM,Green AR,Lambert DG,et al.On the regulation of is chaemia induced glutamate efflux from rat cortex by GABA in vitro studies with GABA,clomethiazole and pentobarbitone [J].Br J Pharmacol,2000,130(5):1124-1130.
  [4]  Green AR,Hainsworth AH,Jackson DM.GABA potentiation:a logical Pharmacological approach for the treatment of acute ischaemic stroke[J].Neuropharmacology,2000,39(9):1483-14941.
  [5] 石向群,陈兴洲.缺血性卒中神经功能恢复的药物治疗研究进展[J].国外医学.脑血管疾病分册,2000,8(3):169.
  [6] 潘永惠,赵庆杰,王德生,等.γ- 羟基丁酸对大鼠局部脑缺血再灌流损伤的保护作用[J].中国临床神经科学,2000,8(3):172 -174.
  [7] 戴光明,郑建,张基谟,等.GABA与脑缺血再灌流后海马迟发性神经元损害[J].国外医学.脑血管疾病分册,1993,1(3):131-133.
  [8] Wilke K,Gaul R,Klauk SM,et al.The GABAA receptor gene family[J].Genomics,1997,45(1):1-10.
  [9] Barnard EA,Skolnick P,Olsen RW,et al.Subtypes of γ-aminobyrytic acid A receptors:classification on the basis of subunit structure and receptor function[J].Pharmacol Rev,1998,50:2911.
  [10] Rudolph U,Mohler H.GABA-based therapeutic approaches:GABAA receptor subtype functions[J].Current Opinion in Pharmacology,2006,6(1):18-23.
  [11] Shimada N,Graf R,Rosner G,et al.Differences in ischemia induced accumulation of amino-acids in the cat cortex[J].Stroke,1990,21(10):1445-1451.
  [12] Douglas BM,Jason EK,Leslie LD,et al.Chronic blockade of N-methyl-D-aspartate receptors alters γ-aminoburytic acidtype A receptor peptide expression and function in the rat[J].J Neurochem,2000,74:1522.

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