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    【摘要】目的 研究丹龙抗痴胶囊提取工艺,以控制其质量,充分提取有效成分,以确保在临床上有效地发挥其治疗作用,保证临床疗效。方法 以丹参酮ⅡA、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1,以及淫羊藿苷的提取量及浸膏得率为评价指标,采用单因素试验及正交试验对丹龙抗痴胶囊的醇提取及水提取的工艺参数进行优选。结果 丹参、远志、三七药材,以75%乙醇为溶媒,回流提取2次,加醇量分别为8、6倍,提取时间分别为1.5、1.0 h；醇提后药渣再与淫羊藿等药材浸泡0.5 h,提取2次,加水量分别为12、10倍量,提取时间分别为2.0、1.5 h。结论 对提取工艺进行验证,工艺稳定可行。

　　【关键词】 丹龙抗痴胶囊　提取工艺　正交试验　丹参酮ⅡA　人参皂苷Rb1　人参皂苷Rg1　淫羊藿苷

 

　　　　丹龙抗痴胶囊由丹参、三七、地龙、远志、淫羊藿等中药组成,具有活血化痰、通窍醒脑之功效,为医院制剂。临床用于治疗血管性痴呆疗效显著,目前正在作为中药新药进行研究与开发。为此,笔者采用正交试验对其提取工艺进行了研究,以确保该制剂在临床上有效地发挥其治疗作用,现将研究结果报道如下。

　　1  材料

　　E-IJ120电子天平(沈阳龙腾电子量程仪器厂)；Waters高效液相色谱仪(美国Waters公司)。丹参酮ⅡA对照品(批号110766-200318)、人参皂苷Rb1、Rg1对照品(批号110704- 200220、110703-200224)、淫羊藿苷对照品(批号110737- 200214),均由中国药品生物制品检定所提供。流动相所用甲醇、乙腈为色谱纯；水为重蒸馏水；其它试剂均为分析纯。丹龙抗痴胶囊中各味药材购自广州清平药材市场,经广东药学院房志坚教授鉴定,符合《中华人民共和国药典》规定的正品。

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　　2  方法

　　2.1  提取工艺的设计

　　丹龙抗痴胶囊由丹参、三七、地龙、远志、淫羊藿等中药组成。根据方中药材所含主要成分的理化性质,并考虑中医传统提取方法多为群药共煎法,为最大限度地使方中药材所含有效成分浸出,确定该制剂药材的提取工艺路线为：丹参、三七、远志用乙醇为溶剂,采用回流法提取,药渣再与淫羊藿等药材合并,用水煎法提取。

　　2.2  分析测试方法

　　浸膏得量测定：精密吸取各次提取液各50 mL,置于恒量的蒸发皿中,于水浴上蒸干,105 ℃干燥3 h,移置干燥器中冷却30 min,迅速精密称重,计算浸膏得量。

　　丹参酮ⅡA,人参皂苷Rb1、Rg1,淫羊藿苷含量测定方法见文献[1]。

　　2.3  丹参、远志、三七醇提工艺的研究

　　2.3.1  浸泡时间的优选

　　取丹参3 g、远志2 g、三七粗颗粒1 g混匀,分别于60%、75%、90%乙醇浸泡0、15、30、45、60 min后抽滤净药材表面可流动溶剂,并对浸泡后药材称重,比较浸泡后药材重量变化,以得到最佳药材浸泡时间(即药材被溶媒完全润透,重量不再增加的时间点),结果丹参、远志、三七的最佳浸泡时间为45 min。

　　2.3.2  提取次数的优选

　　按处方比例取丹参、远志、三七适量,加75%乙醇浸泡45 min,加热回流提取3次,加醇量分别为药材量的8、6、6倍,提取时间分别为1.5、1.0、1.0 h,分别收集各次提取液,准确量取体积。从上述3份提取液中各取适量测定浸膏得量、丹参酮ⅡA浸出量及人参皂苷Rb1、Rg1浸出量,结果以浸膏得量,丹参酮ⅡA浸出量,人参皂苷Rb1、Rg1浸出量为考察指标,第3次提取的量所占比例均很少,故可确定提取次数为2次。

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　　2.3.3  正交试验优选丹参、远志、三七提取工艺条件

　　2.3.3.1  试验设计

　　在浸泡时间、提取次数确定的基础上,选择乙醇浓度(A)、加醇量(B)、提取时间(C)为考察因素,以丹参酮ⅡA浸出量和人参皂苷Rb1、Rg1浸出量及浸膏得率为评价指标,用L9(34)正交表安排试验方案,所选因素水平安排见表1。表1  醇提因素水平表（略）

　　2.3.3.2  试验方法与结果

　　取丹参(丹参酮ⅡA的含量为0.24%)18 g,三七(人参皂苷Rb1、Rg1含量为0.40%)6 g,远志12 g,按正交设计表安排试验,分别加乙醇浸泡45 min,回流提取2次,收集提取液,合并,浓缩定容至500 mL,得各样品溶液。取样进行浸膏得率,人参皂苷Rb1、Rg1浸出量,丹参酮ⅡA浸出量的测定,结果见表2,方差分析见表3～表5。表2  醇提正交试验安排及结果（略）表3  醇提浸膏得率方差分析表（略）注：F0.05(2,2)=19.00表4  丹参酮ⅡA浸出量方差分析表（略）注：F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00表5  人参皂苷Rb1、Rg1浸出量方差分析表（略）注：F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00

　　由上述直观分析与方差分析结果可知：以浸膏得率为评价指标,三因素对浸膏得率均无显著性影响,而以丹参酮ⅡA浸出量为评价指标,最佳提取工艺为A1B3C2,其中A为主要因素,其次是B、C,又以人参皂苷Rb1、Rg1浸出量为评价指标,最佳提取工艺为A2B3C2,其中A为主要因素,其次是B、C。

　　综上所述,结合实际生产情况,醇提最佳提取工艺拟定为A2B3C2,但此方案在正交表中不存在,因此,尚需通过验证试验予以确认。为此,将A2B3C2方案分别与正交表中以丹参酮ⅡA为评价指标的最佳提取方案A1B3C3和正交表中以人参皂苷Rb1、Rg1为评价指标的最佳提取方案A3B3C2进行比较,以确定最佳提取工艺条件。

　　2.3.4  验证试验

　　将A2B3C2、A1B3C3、A3B3C2按各自的提取条件严格进行提取操作,分别收集提取液,定容至500 mL,得样品液,将三份样品平行四份按上述正交试验的操作方法,测定丹参酮ⅡA浸出量和人参皂苷Rb1、Rg1浸出量,结果见表6。表6  验证试验结果（略）

　　由表6可知,A2B3C2与A1B3C3比较,丹参酮ⅡA浸出量相差无几,而人参皂苷Rb1、Rg1浸出量却明显高于A1B3C3方案；A2B3C2与A3B3C2方案比较,结果则相反。这表明A2B3C2方案均优于正交表中的A1B3C2和A3B3C2方案。因此,丹龙抗痴胶囊的最佳醇提工艺可确定为：提取时加75%乙醇,加热回流提取2次,加醇量分别为药材量的8、6倍,提取时间分别为1.5、1.0 h。

　　2.4  淫羊藿、地龙等药材的提取工艺研究

　　2.4.1  提取次数的优选 学术论文发表

　　取淫羊藿(淫羊藿苷含量为1.07%) 20 g、地龙10 g,与处方比例的丹参、三七、远志醇提取后的药渣合并,加水浸泡1 h,加热回流提取3次,加水量分别为药材的10、8、6倍的量,提取时间分别为1.5、1、1 h。分别收集各次提取液,准确量取体积。从上述3份提取液中各取适量测定浸膏得量、淫羊藿苷浸出量,结果在第3次提取液中,无论浸膏得率还是淫羊藿苷浸出量所占比例均已较低；因此,可确定淫羊藿、地龙等药材以2次水提为宜。

　　2.4.2  正交试验优选淫羊藿、地龙等药材的水提工艺条件

　　2.4.2.1  试验设计

　　在确定水提次数的基础上,选择浸泡时间(A)、溶剂量(B)、提取时间(C)为考察因素,以浸膏得率、淫羊藿苷浸出量为考察指标,选用L9(34)正交表,所选因素水平见表7。表7  水提因素水平表（略）

　　2.4.2.2  试验方法与结果

　　取淫羊藿(淫羊藿苷含量为1.07%)20 g、地龙10 g,与处方比例的丹参、三七、远志醇提取后的药渣合并,按正交试验设计表的安排,分别加水浸泡,回流提取2次,收集提取液,浓缩,定容至500 mL,得各样品液,取样进行浸膏得率和淫羊藿苷浸出量的测定。结果见表8,方差分析见表9～表10。表8  水提正交试验安排及结果（略）表9  水提浸膏得率方差分析表（略）注：F0.05(2,2)=19.00表10  淫羊藿苷浸出量方差分析表（略）注：F0.05(2,2)=19.00

　　由上述直观分析和方差分析结果可知：以浸膏得率为评价指标,三因素对其均无显著性影响,而以淫羊藿苷浸出量为评价指标,最佳提取工艺为A1B1C1,其中B为主要影响因素,其次是C、A。因此,丹龙抗痴胶囊的最佳水提工艺可确定为：浸泡0.5 h,提取2次,加水量分别为12、10倍,提取时间分别为2、1.5 h。

　　2.5  中试放大试验

　　按照研究确定的提取工艺路线及参数进行,丹龙抗痴胶囊3批中试规模的验证试验,各项指标检验合格,试验结果表明,丹龙抗痴胶囊的提取工艺基本稳定可行。

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　　3  结论

　　丹龙抗痴胶囊提取工艺优选结果：丹参、三七、远志以75%乙醇为溶媒,回流提取2次,加醇量分别为8、6倍,提取时间分别为1.5、1.0 h。其药渣再与淫羊藿等其余3味药材合并浸泡0.5 h,提取2次,加水量分别为12、10倍量,提取时间分别为2、1.5 h。该提取工艺经过验证,稳定可行。

　　4  讨论

　　丹龙抗痴胶囊由丹参、三七、地龙、远志、淫羊藿等中药组成。丹参为方中君药,主含有效成分有2类：一类为脂溶性萜醌类成分,如丹参酮ⅡA；另一类为水溶性酚性酸类成分,如丹参素原儿茶醛等。现代临床和药理研究表明,丹参脂溶性成分对冠脉供血不良、冠心病、心绞痛有缓解作用,并能提高耐缺氧能力；丹参水溶性成分具有纤溶性作用和抗心肌缺血,此二类成分均是治疗血管性痴呆病的物质基础。据报道,丹参采用先醇提后水提的方法提取,其脂溶性与水溶性有效成分均能较好地浸出[2]。三七的主要有效成分为三萜皂苷,是与人参皂苷类似的一类成分,这类成分有人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rg1、Rg2、Rg3 ,三七皂苷R1、R2、R3、R4、R6等[3-4]。远志的主要成分亦为三萜皂苷类,如远志皂苷A、B、C、D等[5]。对三萜皂苷类,一般用醇类溶剂提取[6]。另据报道,远志甲醇提取物中分离出的酰基糖、占吨酮糖苷与远志的抗痴呆活性有关[3]。而淫羊藿主含淫羊藿苷等黄酮苷类成分,菟丝子主含黄酮类(如金丝桃苷)、氨基酸类等成分,地龙主含氨基酸及酶类等成分[7]。这些成分在水中均有较好的溶解性,故常以水为溶剂提取。

　　根据处方中药材所含主要成分的理化性质,并考虑中医传统提取方法多为群药共煎法,为最大限度地使方中药材所含有效成分浸出,确定该制剂药材的提取工艺路线为：丹参、三七、远志用乙醇为溶剂,采用回流法提取,药渣再与淫羊藿等其余药材合并,用水煎法提取。

　　为保证丹龙抗痴胶囊研究申报注册的提取工艺与实际大生产采用工艺的一致性,进行中试放大的验证试验必不可少。通过对提取工艺进行验证,证实丹龙抗痴胶囊提取工艺稳定可行,为后续的浓缩干燥等工艺研究奠定了坚实的基础。

 

　　参考文献： 

    [1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2000.57,10,267.

　　[2] 刘重芳,朱 艳,戴居云,等.丹参不同提取工艺比较[J].中成药,1999, 21(8)：385.

　　[3] 郑虎占.中药现代研究与应用(第一卷)[M].北京：学苑出版社,1998. 195.

　　[4] 王浴生.中药药理与应用[M].北京：人民卫生出版社,1998.30.

　　[5] 郑虎占.中药现代研究与应用(第三卷)[M].北京：学苑出版社,1998. 21,27.

　　[6] 姚新生.天然药物化学[M].第2版.北京：人民卫生出版社,1994. 361.

　　[7] 郑虎占.中药现代研究与应用(第五卷)[M].北京：学苑出版社,1998. 4113,4228,4879.学术论文发表