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    【摘要】 目的： 观察黄芪注射液对大鼠肾脏缺血再灌注细胞凋亡的影响，探讨其对肾脏缺血再灌注损伤的保护机制。方法： 将实验动物分成假手术组、肾脏缺血再灌注组、黄芪组。测定各组血清尿素氮（BUN）、血清肌酐（Scr）水平及肾组织丙二醛（MDA）水平，超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脱氢酶（LDH）、氧化亚氮（NO）、氧化亚氮合酶（NOS）活性；HE染色观察肾组织病理变化情况，并进行中性粒细胞（PMN）计数；TUNEL法观察肾组织细胞凋亡情况。结果： 黄芪组血清BUN，Scr水平，肾组织匀浆MDA水平、LDH活性较缺血再灌注组显著下降，SOD，NO，NOS活性较缺血再灌注组显著升高；肾组织切片镜下显示缺血再灌注组肾小管大量坏死、变性、管内扩张出血，部分肾小球内亦出现红细胞，黄芪组肾小管、肾小球病变减轻较为明显；中性粒细胞（PMN）数黄芪组较缺血再灌注组显著减少；TUNEL法测定肾小管上皮细胞阳性凋亡率黄芪组较缺血再灌注组明显减少。结论： 黄芪可以通过增加肾组织NO水平，减少氧自由基，抑制细胞凋亡而减轻肾脏缺血再灌注损伤。

　　【关键词】肾脏缺血再灌注损伤；黄芪； 氧化亚氮； 丙二醛； 细胞凋亡

 

 

　　　　肾脏缺血再灌注（renal ischemia?reperfusion,RIR）是临床常见的病理生理变化，一般认为，该损伤所致的细胞死亡这一病理学结局代表细胞在增加新陈代谢需求的情况下，对储存能量的耗竭所做出的被动反应。缺血如果能够及时纠正，并且能够尽可能避免或减少再灌注性损伤，肾功能可不受影响或很快恢复正常；但当肾脏局部缺血不能在机体自身神经体液等因素的调节下进行有益的平衡时，该缺血和随后的再灌注损伤可导致不正常的信号转导或细胞功能的异常，引发一系列凋亡事件和坏死。

　　近年来，人们开始关注细胞凋亡对大鼠脑和心肌缺血再灌注损伤的影响，但其对肾脏缺血再灌注损伤的影响还鲜见报道。本实验观察黄芪对大鼠缺血再灌注肾脏细胞凋亡的影响，并试图阐明其中的机制。

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　　1  材料和方法

　　1.1  材 料

　　1.1.1  实验动物  雄性SD大鼠48只，体质量250～300 g，由江苏大学临床医学院实验动物中心提供。

　　1.1.2  主要试剂和材料

　　尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脱氢酶（LDH）、氧化亚氮（NO）、氧化亚氮合酶（NOS）试剂盒均购自南京建成生物研究所；黄芪注射液由成都地奥九泓制药厂生产；细胞凋亡试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物模型及实验分组

　　缺血再灌注组模型制备如下：实验前大鼠禁食12 h，不限饮水，术前30 min腹腔注射生理盐水6 ml/kg，后以5％戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔麻醉，仰卧位固定，腹壁中线切开，上至剑突，下至耻骨联合，用浸温生理盐水的湿纱布包裹肠道，结扎右肾动、静脉后进行右肾切除，游离左肾蒂，以无创动脉夹夹闭肾动脉后开始计时，1 h后松开动脉夹，左肾由暗红逐渐变为鲜红，表明再灌注手术成功。缝合腹部伤口，放回鼠笼饲养，再灌注24 h。大鼠随机分为3组：①假手术组（n=16）：术前30 min腹腔注射生理盐水6 ml/kg，不夹闭肾动、静脉，其余同缺血再灌注组模型制备。②缺血再灌注组（n=16）：即缺血再灌注组模型制备。③黄芪组（n=16）：术前30 min腹腔注射黄芪注射液6 ml/kg，其余同缺血再灌注组。

　　1.2.2  血清BUN，Scr，肾组织匀浆MDA，SOD，NO，NOS，LDH测定

　　心室取血6～8 ml，3 000 r/min离心10 min，取上清，测Scr，BUN含量。并立即分离左肾在冰生理盐水制成10%肾组织匀浆，测MDA，SOD，NO，NOS，LDH含量。 Scr，BUN，MDA，SOD，NO，NOS，LDH均采用化学比色法，按试剂说明书操作，蛋白含量测定采用双缩脲法。

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　　1.2.3  肾组织切片制备

　　每组16只大鼠中取8只用于低聚甲醛固定。先从腹主动脉注入生理盐水并将肾静脉剪开，后用4%低聚甲醛从腹主动脉注入直至肾组织发硬，再放入4%低聚甲醛中后固定，石蜡包埋，待做HE染色和细胞凋亡检测。

　　1.2.4  肾组织切片HE染色

　　苏木素染色30 s，水冲洗后伊红染色2 min，用水冲洗，中性树胶封固。病理切片分级标准［1］：±为基本正常；+为轻度损伤，被膜有炎细胞浸润，其余均轻；++为中度损伤，血管扩张充血、部分肾小管管腔内有红染蛋白物，偶见凋亡小体；+++为重度损伤，血管扩张，充血明显，较多肾小管管腔内有红染蛋白物及凋亡小体。

　　1.2.5  中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophils, PMN）

　　计数  肾组织HE染色，光镜100倍下对8个连续不重叠的视野进行中性粒细胞计数。

　　1.2.6  肾组织细胞凋亡检测

　　采用TUNEL法检测，每例石蜡切片均取一张常规脱蜡入水，用新鲜配制的体积分数为3% H2O2处理，蒸馏水洗涤。加入以Tris缓冲盐水（TBS）1∶100新鲜稀释的蛋白酶K，37℃10 min，蒸馏水洗；加含TdT 和DIG?dUTP的标记缓冲液20 μl，37℃，2 h，TBS洗涤；加封闭液50 μl,室温30 min，甩干；加入以封闭液1∶100稀释的抗DIG生物素50 μl，37℃，30 min，TBS洗涤；加入以TBS 1∶100稀释的链霉亲合素?生物素?过氧化物酶复合物(SABC)，37℃，30 min，TBS洗涤，然后用3,3?二氨基联苯胺盐酸盐（DAB）显色 20 min，蒸馏水洗涤；苏木素复染，TBS洗涤；脱水，透明，封固。将切片置高倍镜下观察，细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性凋亡细胞，对8个连续不重叠的视野中阳性细胞进行计数。

　　1.3 统计学处理

　　采用SPSS13.0软件，组间差异采用方差分析。

　　2  结 果

　　2.1  3组血清中肌酐和尿素氮测定结果

　　与假手术组相比，缺血再灌注组血清Scr，BUN明显升高，黄芪组Scr，BUN低于缺血再灌注组。见表1。 表1  3组血清肌酐、尿素氮测定结果（略）

　　2.2 肾组织匀浆中MDA，SOD，NO，NOS，LDH，PMN数目测定结果

　　与假手术组相比，缺血再灌注组肾组织匀浆MDA水平，LDH活性，PMN数明显升高，SOD，NO，NOS活性显著下降。黄芪组MDA水平、LDH活性、PMN数低于缺血再灌注组，SOD，NO，NOS活性高于缺血再灌注组。见表2。

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　　2.3 肾组织形态学观察结果

　　光镜下可见假手术组未见明显异常。缺血再灌注组大量肾小管上皮细胞肿胀、上皮细胞坏死，部分小管腔内有蛋白性液体和红细胞。肾间质血管高度扩张充血、炎细胞浸润明显。黄芪组损伤程度明显减轻，仅有少数肾小管上皮细胞的肿胀，间质血管扩张充血明显减轻。见表3。表2  肾组织匀浆中MDA，SOD，NO，NOS，LDH，PMN数目测定结果（略）表3  肾组织损伤程度观察结果（略）

　　2.4 肾组织细胞凋亡情况

　　凋亡细胞的核固缩，呈棕黄色颗粒，凋亡主要发生在肾小管尤其是远端小管，少数见于近端小管和肾小球脏层上皮细胞。与缺血再灌注组相比，黄芪组阳性细胞数明显减少。假手术组很少见到凋亡细胞。见表4和图1。表4  肾组织细胞凋亡情况（略）

　　3 讨 论

　　细胞凋亡又称程序性细胞死亡（programmed cell death, PCD），是1972年Kerr等［2］提出的一种不同于细胞坏死的自然死亡过程，由特定的基因调控，是维持机体自身稳定的一种重要机制。缺血再灌注损伤与细胞凋亡有密切的联系，细胞凋亡可能在缺血再灌注损伤中起重要作用［3］。但缺血再灌注损伤时细胞凋亡的机制仍未阐明。

　　体内的NO由氧化亚氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）生成，体内NO水平高低和NOS的多少及其活性有密切的关系。在NO与细胞凋亡之间的关系存在分歧，有学者认为NO会诱导细胞凋亡，NO作为一种自由基，它与O-2结合可生成过氧亚硝基（ONOO-）［4］，其又可在酸性环境下分解成毒性更强的自由基如NO2和OH-等，导致内皮细胞水肿，血小板、中性粒细胞聚积，血管调节异常。ONOO-引起的氧化损伤是NO具有细胞毒性的重要原因之一［5，6］，ONOO-尚可诱导细胞凋亡。也有学者报道NO对细胞凋亡有抑制作用。在本次实验中，我们发现缺血再灌注组NO和NOS表达较假手术组显著减少，两组比较差异有统计学意义（P<0.01），缺血再灌注组的凋亡细胞却明显增加，凋亡主要发生在肾小管尤其是远端小管，一部分位于肾小管的管腔内，少数见于近端小管和肾小球毛细血管内皮细胞。而且发现缺血再灌注组NO，NOS降低，BUN，Scr，LDH却显著升高。从形态学观察结果也表明缺血再灌注组肾组织发生了明显的损伤性改变。根据以上的结果，我们认为NO可以通过抑制细胞凋亡对肾脏缺血再灌注损伤具有保护作用，缺血再灌注组中NO合成减少，从而导致肾组织的严重损伤和大量的细胞凋亡。

　　我们认为肾缺血再灌注中细胞凋亡与NO和自由基有关，同时NO和氧自由基也有着联系。由于NO使得血管扩张，而缺血再灌注后NO合成受限，组织细胞缺氧更加严重，释放大量白细胞的趋化因子和协同激活因子而促进白细胞的聚集、溢出和活化，激活的中性粒细胞在吞噬活动时耗氧量显著增加，产生大量氧自由基。从实验结果来看，缺血再灌注后PMN数量和自由基水平都显著增加。

　　黄芪为多年生草本植物。传统医学认为，黄芪为补气药，具有补气升阳，益卫固表，托毒排脓，益气利水的功效。从西医角度上讲即具有抗炎、利尿、强心及促进免疫等多种作用。黄芪的活性成分对多种自由基均有良好的清除作用，可预防生物膜的脂质过氧化［7］，其中黄芪总黄酮为黄芪抗氧化的主要活性成分［8］。另外黄芪的四种成分刺花柄花素、阿佛洛莫生、毛蕊异黄酮和奥力拉亭也具有防止脂质过氧化作用，减少自由基产生［9］。本次实验结果显示预先注射黄芪注射液后，凋亡细胞较缺血再灌注组显著减少，同时NO和NOS活性明显升高，MDA和LDH水平均显著上升，SOD活性显著下降。因此，我们认为黄芪可以通过增加NO水平和减少氧自由基来抑制肾小管上皮细胞凋亡，从而对肾脏缺血再灌注损伤具有保护作用。

　　综上所述，细胞凋亡是肾脏缺血再灌注损伤的表现形式之一，NO和氧自由基分别有抑制和促进细胞凋亡的作用，黄芪可能通过增加NO的活性和减少氧自由基来抑制肾小管上皮细胞凋亡，从而对肾脏缺血再灌注损伤具有保护作用。

　　参考文献： 

    ［1］Walker PD. Alterations in renal tubular extracellular matrix components after ischemia?reperfusion injury to the kidney［J］. Lab Invest, 1994,70(3):339-345.

　　［2］Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR,et al. Apoptosis:a basic biological phenomenon with wide?ranging implications tissue kinetics［J］.Br J Cancer,1972,26(4):239-257.

　　［3］Sasaki H, Matsuno T,Tanaka N,et al .Activation of apoptosis during the reperfusion phase after rat liver ischemia［J］.Transplan Proc,1996,28(3):1908-1915.

　　［4］Juliet PA, Hayashi T, Iguchi A,et al. Concomitant production of nitric oxide and superoxide in human macrophages［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 310(2):367-370.

　　［5］Brüne B, Zhou J, von Knethen A. Nitric oxide, oxidative stress, and apoptosis［J］. Kidney Int Suppl, 2003(84): 22-24.

　　［6］Brown GC, Borutaite V. Nitric oxide, mitochondria, and cell death［J］. IUBMB Life, 2001, 52(3/5): 189-195.

　　［7］许静，秦小红，薛梅. 黄芪对D?半乳糖衰老大鼠脂质过氧化及红细胞免疫功能的影响［J］. 江苏医药, 2007，33(6): 596-597.

　　［8］陈聪颖，陆阳，陈泽乃. 内蒙黄芪的研究概况［J］. 中草药, 2001，32(6): 89-91.

　　［9］何勇. 黄芪提取物对心肌缺血再灌注损伤的保护作用［J］. 中药新药与临床药理,2008，19(2): 100-102