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    【摘要】  目的：探讨褪黑素对大鼠脊髓损伤后诱生型一氧化氮合酶 (iNOS)表达的影响。方法：采用改良 Allen′s撞击法制备脊髓损伤模型；成年SD大鼠110只随机分为假损伤组、损伤组和药物治疗组 3组，其中损伤组和药物治疗组各50只，分5个时间点（8小时、24小时、72小时、7天、14天）处死；假损伤组10只，于手术后14天处死，采用HE 染色和免疫组化检测脊髓损伤后脊髓组织中 iNOS蛋白的表达。结果：与损伤组比较,药物治疗组大鼠损伤后脊髓组织 iNOS表达明显降低,差异有统计学意义 (P＜0.05)。结论：褪黑素可通过抑制 iNOS蛋白表达对大鼠脊髓损伤起保护作用。

　　【关键词】  脊髓损伤;褪黑素;诱生型一氧化氮合酶

　　　脊髓损伤 (spinal cord injury, SCI)后的继发性损伤是一个复杂的病理过程, 包括兴奋性氨基酸、氧化性代谢产物和致炎细胞因子等多种效应因子的释放，可导致脊髓组织不可逆损害，表现为不同程度的运动、感觉和自主神经功能障碍。一氧化氮 (NO)作为在体内广泛存在并具有多重生物学效应的信号介质可能起很重要的作用，体内NO由一氧化氮合酶 (nitric oxide synthase, NOS)生成,NOS广泛存在于包括中枢神经系统在内的各系统中。NOS有3种亚型,其中诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)产生的 NO量大、持续时间长,通过直接引起过氧化损伤或作为信号介质介导其它炎症因子而起作用，表现出强的神经毒性。褪黑素(5-甲氧基-N-乙酰色胺,melatonin,MT)主要是由松果体分泌的激素,能直接清除自由基,减轻细胞的过氧化损害[1]。本试验通过观察大白鼠脊髓损伤后腹腔注射褪黑素对iNOS表达的影响，分析褪黑素在脊髓继发性损伤中的可能作用，为临床治疗继发性脊髓损伤提供理论及实验依据，也为进一步实验研究提供资料。

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　　1  材料与方法

　　1.1  主要仪器与试剂  Olympus光学显微镜图像采集系统显微图像分析系统(日本)，褪黑素购自晶美北京分公司(瑞士Alexis公司生产)，兔抗大鼠iNOS多克隆抗体免疫组化试剂盒、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司提供。

　　1.2  实验动物与分组  健康成年SD大鼠110只,雌雄各半,体重250～330g。随机分为假损伤组、损伤组和药物治疗组3组。其中损伤组和药物治疗组各50只，分5个时间点（损伤后8小时、24小时、72小时、7天、14天）处死；假损伤组10只，于手术后14天处死。药物治疗组术后立即给予褪黑素每天50mg/kg，腹腔注射，连用7天;而假手术组和损伤组给予等量含5%无水乙醇的生理盐水。

　　1.3  动物模型的建立  采用改良Allen's撞击法，10%的水合氯醛按300mg/kg体重腹腔麻醉，俯卧位固定，常规碘伏消毒铺巾，以T10棘突为中心行背侧正中纵切约 2.5cm,行T9、10椎板切除术，暴露硬脊膜，在硬膜表面垫一弯曲度与脊髓表面一致的塑料垫片,用重10g金属棒从4.0cm高处沿中空玻璃管垂直自由落下撞击脊髓，造成急性脊髓损伤，假手术组只做T9、10椎板切除术，显露硬脊膜，不用重物撞击。造模成功的标志为大鼠的双下肢呈回缩性扑动、尾巴出现痉挛性摆动。造模成功的动物每天给予截瘫护理，每日人工排尿排便3次。

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　　1.4  取材和HE染色  将各组大鼠在各相应时间点麻醉下开胸,经左心室-主动脉插管心脏灌注固定,先用等渗盐水约250mL冲洗至流出澄清液,再用4%多聚甲醛约200mL灌流至动物完全僵硬,完整取出包括损伤段及其上下约1cm脊髓组织。迅速用4%甲醛液进行固定过夜，脱水，石蜡包埋，4μm连续切片，做HE染色,观察病理改变。

　　1.5  免疫组织化学染色及图像分析  切片脱蜡水化后,用3%过氧化氢室温孵育 10分钟,灭活内源性过氧化氢酶;5%BSA室温封闭 20分钟;加入1∶80稀释兔抗大鼠iNOS多克隆抗体 4℃过夜;滴加生物素化羊抗兔IgG 37℃ 20分钟;滴加SABC 37℃孵育 20分钟;DAB显色,苏木素复染,封片。以PBS代替一抗作阴性对照。镜下观察阳性细胞胞浆呈棕黄色,每组抽取一张切片，每张切片任选5个高倍视野,应用显微图像分析系统测定iNOS阳性细胞百分率和平均灰度值,取其平均值。

　　1.6  统计学分析  用SPSS13.0软件包进行统计,各组数据采用x±s表示,阳性细胞百分率和平均灰度值，采用两独立样本均数的t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

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　　2.1  HE染色  假损伤组表现为正常脊髓组织的特点,显示灰白质交界清楚，神经元丰富，胞体大，核仁明显。损伤组伤后8小时见灰、白质界限不清，有大量红细胞渗出，神经细胞变性；伤后24小时后大量出血、明显水肿、神经细胞变性、神经元核浓聚；伤后72小时部分出血灶融合成小片状，水肿明显，神经元变性，神经元固缩、坏死、溶解，部分出现坏死;伤后7天充血水肿减轻，灰、白质有多个出血灶融合；神经元、胶质细胞变性，部分崩解，神经元数量减少；灰、白质区均有空洞形成，大量小胶质细胞浸润，有炎细胞浸润，毛细血管形成;伤后14天充血水肿消退，灰、白质区均有空洞，神经胶质增生明显，较多结缔组织增生。药物治疗组与损伤组相比，各时间点组织水肿较轻，出血较少，空洞形成较少，神经元细胞较多，脊髓损伤均有不同程度的减轻。见图1、图2。

　　图1  损伤组24小时（略）

　　图2  药物治疗组24小时（略）

　　2.2  免疫组化检测结果  假损伤组未见iNOS蛋白表达。脊髓损伤后,损伤组神经元、神经胶质细胞等中均可见不同程度的iNOS表达,以神经元为主。损伤后8小时阳性细胞有表达, 损伤后1天、3天表达增加明显,7天达高峰,14天逐渐降低。与损伤组比较,褪黑素治疗组各时间点脊髓组织iNOS蛋白表达降低，高峰亦发生在损伤后7 天，阳性细胞百分率均显著降低，平均灰度值均显著升高(P<0.05)。见表1。

　　表1  大鼠脊髓iNOS免疫组化表达阳性指标测定（略）

　　注：△与同时间损伤组比较P<0.05,△△与同时间损伤组比较P<0.01

　　3  讨论

　　SCI后的继发性损伤是一个复杂的病理过程,包括兴奋性氨基酸、氧化性代谢产物和致炎细胞因子等多种效应因子的释放，可导致脊髓组织不可逆损害。研究认为急性脊髓损伤后脊髓局部缺血、坏死,引起多种炎症介质释放,并引发兴奋毒性级联反应,诱导iNOS高表达,产生过量的具有神经毒性作用的NO,是造成急性脊髓损伤后继发性神经元死亡的直接因素[2]。NO作为在体内广泛存在并具有多重生物学效应的信号介质在SCI的继发性损伤中可能起很重要的作用，体内NO由NOS催化生成,NOS广泛存在于包括中枢神经系统在内的各系统中。一氧化氮合酶有三种异构体，分别为内皮细胞型一氧化氮合酶(eNOS)、神经元型一氧化氮合酶（nNOS)和诱生型一氧化氮合酶（iNOS）。 eNOS和nNOS合称固有型一氧化氮合酶（cNOS)，cNOS的活性为钙依赖性，在正常生理条件下，催化合成基础量的NO，抑制血小板聚集和粘附，从而维持血管舒张状态，维持组织器官血流量在生理水平[3];而iNOS的活性为非钙依赖性，在正常生理状态下含量极微[4]。组织细胞急性缺血早期，谷氨酸释放增加，激活NMDA受体，受体介导性钙内流增多，激活cNOS使NO生成增加。少量增加可以对抗创伤和缺血应激引起的血管收缩。随着损伤区中性粒细胞浸润、炎性因子产生，转录因子NF-KB活化，使iNOS表达增加[5],iNOS的活性为非钙依赖性，一旦合成，持续催化生成大量的NO。体内大量的 NO导致自由基O-·2生成增多，或与自由基O-·2反应生成作用更强的自由基ONOO-[6]。ONOO-氧化线粒体Mn-SOD使O-·2进一步积聚增加[7]。

　　褪黑素（MT）主要由松果体分泌,是存在于人体内的重要神经内分泌活性物质,具有调节昼夜节律等重要功能。近年来研究发现MT具有很强的清除羟自由基和过氧自由基作用[8],不仅可直接清除OH-、O-·2等,还可通过增加抗氧化酶的活性发挥抗氧化作用,是目前已知体内最强的抗氧化成分。MT清除氧自由基的活性不需要其受体的调节,MT抗氧化能力至少部分是通过直接清除自由基[9]。MT作为松果体分泌的激素,它具有高脂溶性和水溶性,能通过核膜进入核内发挥作用,能使脱氧核糖核酸免受到氧的毒性作用[10]。因此MT不仅保护膜脂质,而且保护蛋白质、核酸及细胞的其他成分。McCann等[11]发现NO可以激起松果体分泌MT增加，消除NO，减少NO神经毒性，MT尚能显著抑制iNOS基因相关表达。亦有研究表明,褪黑素还可直接清除一氧化氮[12]。NOS是产生自由基的酶之一,可促进一氧化氮的合成,一氧化氮与过氧化硝酸盐结合产生自由基。褪黑素能抑制 iNOS的产生,从而减少毒性一氧化氮的生成。还有研究发现褪黑素可通过抑制谷氨酸引起的NO释放增加,对抗其神经毒性,保护神经细胞免受损伤,为损伤后神经细胞的恢复创造了有利条件[13]。

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　　本实验结果显示，脊髓损伤后,损伤组神经元、神经胶质细胞等中均可见不同程度的iNOS表达,以神经元为主。损伤后8小时阳性细胞有表达,损伤后1天增加明显,7天达高峰,14天逐渐降低。与损伤组比较,褪黑素治疗组各时间点脊髓组织iNOS蛋白的表达降低，高峰前移，发生在损伤后3天，阳性细胞百分率均显著降低，平均灰度值均显著升高，差异有统计学意义；治疗组大鼠脊髓组织病理改变较轻。提示褪黑素可能通过抑制脊髓组织中iNOS的表达，减轻脊髓损伤后的继发性损害，起到保护脊髓的作用。但对抑制iNOS的具体机制仍不清楚，需要进一步的研究。

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