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    【摘要】目的：观察蛹虫草提取物(cordyceps militaris extract,CME)联合地塞米松(dexamethasone,Dex)对大鼠角膜新生血管的抑制作用。方法：对48只大鼠采用碱烧伤法制作大鼠角膜新生血管模型，后随机分为3组：A组为模型对照组，B组为CME治疗组，C 组为CME联合Dex治疗组。造模后每组均隔日注射给药，A组给予生理盐水结膜下注射，B组给予CME 10mg球结膜下注射，C组给予CME10mg球结膜下注射，另外给予0.25g/L Dex滴眼液点眼，3次/d。于术后4，8，14d测量角膜新生血管的生长面积，并测量角膜组织中VEGF及其mRNA的表达情况。结果：造模后联合用药组的大鼠角膜新生血管生长面积较模型对照组及CME治疗组明显减少，差异均具有统计学意义（P<0.05）。 结论：CME联合Dex更能明显抑制碱烧伤所致大鼠角膜新生血管的生长。

     【关键词】 蛹虫草提取物；地塞米松；角膜新生血管；血管内皮生长因子

　　0　引言

　　角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV) 是常见的致盲性眼病之一,也是角膜移植术后发生排斥反应的高危因素。局部应用糖皮质激素是目前临床上的主要治疗手段,但其易诱发角膜穿孔、青光眼、白内障等严重并发症，因而寻找安全有效的治疗CNV的药物一直是眼表研究的热点。蛹虫草主要用于抗肿瘤和增强免疫等治疗，近来国外有报道其有抗新生血管生成的作用，但尚未见有抗眼部新生

　　血管的报道。我们的前期研究已证实，蛹虫草提取物（cordyceps militaris extract,CME）对大鼠CNV

　　具有抑制作用，其高剂量与0.5g/L地塞米松(dexamethasone，Dex)的抑制作用相当。我们将 CME与Dex

　　联合用药，观察对大鼠CNV的抑制作用。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　蛹虫草子实体，购自广东冬草堂虫草有限公司；0.25g/L Dex滴眼液，购自湖北潜江制药有限责任

　　公司。清洁级健康雌性Sprague Dawley（SD）大鼠48只(华中科技大学同济医学院动物实验中心提供) ,

　　体质量220～250g。CME的制备采用水热回流提取法[1]：取蛹虫草子实体粉末50g，加10倍量的蒸馏水（

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　　500mL）于80℃热回流提取3 次，每次90min。合并滤液，减压浓缩，真空干燥器内干燥至粉末，4℃保

　　存备用。0.25g/L Dex滴眼液，采用潜江制药公司生产的滴眼液原液。图1大鼠碱烧伤后14d CNV生长情

　　况  A：模型对照组；B：CME治疗组；C：CME+Dex治疗组。

　　1.2　方法

　　采用100g/L水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉，所有实验大鼠均选择右眼，裂隙灯下检查眼前节无病变

　　。10g/L地卡因眼液表面麻醉，将统一规格直径3.0mm的单层圆形滤纸浸入浓度为1mol/L氢氧化钠溶液

　　20s，吸干滤纸上残余溶液后将其准确贴附于右眼角膜中央表面40s，取下滤纸后立即用生理盐水冲洗

　　2min。烧伤术后即观察大鼠右眼角膜，烧灼区域呈灰白色混浊，依据评分标准[2]确认中度碱烧伤模型

　　建立。术后术眼点红霉素眼膏预防感染。抽签法随机将大鼠分成A,B,C 3组（A组:模型对照组；B组：

　　CME治疗组；C组：CME+Dex治疗组），每组15只。A组给予生理盐水0.1mL球结膜下注射。B组给予CME

　　10mg经无菌注射用水稀释为0.1mL后行球结膜下注射。C组给予CME 10mg球结膜下注射，另给予0.25g/L

　　Dex滴眼液点眼，3次/d。每组均自术日起隔日球结膜下注射，给药至处死取材为止。于术后第4,8,14d

　　采用过量麻醉法处死大鼠,每次6只,迅速摘除眼球,在显微镜下剪下带1mm宽巩膜的角膜组织,平分为二，

　　均置于?80℃低温冰箱备用，一份用于real time PCR检测VEGF基因水平的表达，另一份用于ELISA检测

　　VEGF蛋白水平的表达。

　　1.2.1　CNV的定量分析

　　角膜烧伤后各时间点行裂隙灯显微镜检查，测量新生血管长入角膜的长度及累及角膜圆周的钟点数

　　，计算其面积。新生血管面积计算依据Robert公式[3]:S=C/12×3.1416[r2? (r?l)2],其中C代表新生

　　血管累及角膜圆周的钟点数, l代表新生血管的长度（在显微镜下用游标卡尺测量，测量生长较长、弯

　　曲度小、并与角膜缘切线垂直的新生血管）, r代表角膜半径。

　　1.2.2　角膜VEGFmRNA表达的检测 职称论文发表网

　　角膜总RNA提取参照Trizol说明书(大连宝生物公司)，对保存在?80℃冰箱中的角膜组织总RNA进行

　　提取与纯化,然后逆转录为 cDNA。Real time PCR 按照试剂盒(大连宝生物公司)说明书进行操作,采用

　　25μL反应体系,以β?actin 为内参照。PCR反应条件: 95℃预变性30s, 95℃5s, 60℃ 30s,循环40次

　　。每例样本均设3个平行复孔，取均值。VEGF和β?actin引物由大连宝生物工程有限公司合成。VEGF上

　　游引物: 5?GTCCTCACTTGGATCCCGACA?3?, 下游引物: 5??CCTGGCAGGCAAACAGACTTC?3?,扩增片断

　　为99bp;β?actin上游引物: 5??GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA?3?,下游引物: 5??

　　GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG?3?,扩增片断为150bp。

　　1.2.3　角膜VEGF表达的检测

　　经电子天平称量，所有标本每个定量为0.005g。将标本放入研钵，加0.01mol/L PBS缓冲液100μL

　　研磨匀浆，使之呈现混悬液状，装入EP管，4℃ 5000r/min离心10min，收集上清液，?80℃冷冻保存，

　　夹心法ELISA检测。

　　统计学分析：实验数据应用SPSS 13.0统计软件包进行处理，总体均数间比较采用单因素方差分析

　　，各组均数间两两比较采用q检验，以P<0.05为有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　CNV生长面积

　　模型对照组于角膜烧伤后3d开始长入新生血管，CME组与联合用药组于烧伤后4d开始长入新生血管

　　，均于8d左右生长速度达高峰，其后生长变缓，到两周时部分CNV开始消退(图1)。在烧伤后4,8,14dCME

　　治疗组与联合治疗组CNV面积均小于模型对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），联合治疗组与CME治

　　疗组比较，差异亦具有统计学意义（P<0.05）。统计结果显示，联合治疗组更能明显抑制CNV的生长(表

　　1)。表1大鼠CNV面积和VEGF表达水平（略）

　　2.2　角膜VEGFmRNA的表达

　　烧伤后B，C组mRNA的表达明显低于模型对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，B，C组之间差异亦

　　具有统计学意义 (P<0.05，表1)。

　　2.3　角膜VEGF的表达

　　在各时间点联合用药组较模型对照组及CME组均低表达，差异均具有统计学意义(P<0.05，表1)，这

　　与VEGFmRNA表达水平具有一致性。

　　3　讨论

　　CNV属于难治性角膜疾病之一，常常导致患者视力下降，严重者可致失明。蛹虫草是一种名贵的中

　　药材，其应用于临床有悠久的历史。近年来的研究显示，蛹虫草具有抗癌、调节免疫、抗理作用[4?6]

　　。最近国外的研究显示，CME能够抑制新生血管的发生，它能抑制人脐静脉内皮细胞的增殖 [7]和鸡胚

　　绒毛尿囊膜的血管生成[8]。我们前期的研究显示，CME能够有效抑制碱烧伤所致的大鼠CNV的生长，高

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　　剂量抑制作用与0.5g/L的Dex 相当。我们仍然采用碱烧伤法制作大鼠CNV模型，联合运用CME及Dex，观

　　察联合用药对CNV生长的抑制作用及其副作用的大小。实验结果显示，联合用药比CME单独用药更能有效

　　抑制大鼠CNV的生长，且副作用不明显。这就提示，如能将蛹虫草开发成有效的抑制新生血管的药物，

　　在治疗上辅以低浓度的糖皮质激素，可以明显提高治疗效果且有效降低副作用，从而为CNV的药物治疗

　　提供新的思路。

 

　　参考文献： 

   　　1　王英娟,李多伟,王义潮,等.蛹虫草中虫草素、虫草多糖综合提取工艺研究.西北植物学报2005

　　；25(9):1863?1867

　　2　Bergers G, Javaherian K, Lo KM, et al. Effects of angiogenesis inhibitors on

　　multistage carcinogenesis in mice. Science 1999;284(5415):808?812

　　3　Kato T, Kure T, Chang JH, et al. Diminished corneal angiogenesis in gelatinase A?

　　deficient mice. FEBS Lett 2001;508(2):187?190

　　4　Thomadaki H, Tsiapalis CM, Scorilas A. The effect of the polyadenylation inhibitor

　　cordycepin on human Molt?4 and Daudi leukaemia and lymphoma cell lines. Cancer Chemother

　　Pharmacol 2008;61(4):703?711

　　5　Zhou X, Luo L, Dressel W, et al. Cordycepin is an immunoregulatory active

　　ingredient of Cordyceps sinensis. Am J Chin Med 2008;36(5):967?980

　　6　Wang YH, Ye J, Li CL, et al. An experimental study on anti?aging action of

　　Cordyceps extract. Zhongguo Zhongyao Zazhi 2004;29(8):773?736

　　7　Yoo HS, Shin JW, Cho JH, et al. Effects of Cordyceps militaris extract on

　　angiogenesis and tumor growth. Acta Pharmacol Sin 2004;25(5):657?665

　　8　Won SY, Park EH. Anti?inflammatory and related pharmacological activities of

　　cultured mycelia and fruiting bodies of Cordyceps militaris. J

　　Ethnopharmacol 2005;96(3):555?561