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    【摘要】　目的 通过观察何首乌饮干预的衰老大鼠下颌下腺β?半乳糖苷酶（β?gal）表达的改变，探讨何首乌饮的抗衰老作用。方法 用D?半乳糖制造衰老大鼠模型，何首乌饮的干预作用分治疗和预防两部分，检测β?半乳糖苷酶活性，观察下颌下腺衰老细胞数目改变。结果 预防性实验部分：模型组衰老细胞数目多于正常组和各预防性用药组；治疗性实验部分：用药各组与自然恢复组相比，衰老细胞数目明显减少，其中治疗中剂量组最低。结论 何首乌饮具有抗模型大鼠下颌下腺细胞衰老的作用。

　　【关键词】 何首乌；D?半乳糖；衰老大鼠；下颌下腺；β?半乳糖苷酶

　　　　衰老是在生物发育成熟后，随年龄的增加，机体的器官、组织出现功能、形态的退变乃至老化的过程。下颌下腺是具有外分泌和内分泌双重功能的腺体，能够分泌70%的唾液和近50种生物活性物质，其分泌的某些生物活性物质完全达到激素水平，对机体多种组织、器官有重要的支持、营养及调节作用。近年来，关于下颌下腺功能的研究逐渐深入，但对其衰老与抗衰老的研究却少有报道。本实验采用D?半乳糖诱发的亚急性衰老模型，通过对β?半乳糖苷酶活性的检测，观察下颌下腺衰老细胞数目的改变；探讨何首乌饮对衰老大鼠下颌下腺的影响，为何首乌饮在延缓组织退行性改变、增强老年性保健、预防衰老性涎腺疾病方面奠定研究基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料与仪器

　　何首乌饮方剂由炙何首乌、怀牛膝、肉苁蓉、淫羊藿、丹参、茯苓组成，由本院贾春华教授提供；实验大鼠购自河北省实验动物中心，合格证编号：605106。

　　1.2  实验动物的选择及分组

　　选用8周龄清洁级SD雌性大鼠90只，体重180～220 g，随机分为预防性和治疗性两大实验部分，每部分5组，每组9只。

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　　1.3  模型的建立及各组动物的处理方法

　　预防性用药部分：正常组(N)大鼠正常喂60 d；模型组(M)大鼠腹腔注射D?半乳糖（300 mg·kg-1·d-1），连续 60 d；何首乌饮（H

　　SWY）预防高(Ph)、中(Pm)、低 (Pl) 剂量组大鼠腹腔注射D?半乳糖的同时分别灌胃何首乌饮（3.872，1.936，0.968 g·100 g-1·d-1，水煎浓缩成0.6 ml·100 g-1·d-1），每天1次，连续60 d。治疗性用药部分：阴性对照组(NC)大鼠按0.5 ml·100 g-1·d-1腹腔注射生理盐水，连续60 d后灌胃生理盐水0.6 ml·100 g-1·d-1，连续60 d。自然恢复组(S?R)大鼠腹腔注射D?半乳糖，连续60 d后正常喂养60 d。HSWY治疗高(Th)、中(Tm)、低(Tl)剂量组大鼠腹腔注射D?半乳糖，连续60 d后分别灌胃何首乌饮（剂量同上），每天1次，连续60 d。

　　1.4  新鲜标本的取材

　　各组大鼠末次给药后1 h，10%水合氯醛(0.3 ml/100 mg)腹腔注射麻醉，剪开颈部皮肤，分离并摘取下颌下腺，置液氮中保存备用。

　　1.5  组织衰老特异性β?

　　半乳糖苷酶冰冻切片的制备及染色  准备厚为10 μm的冰冻切片，按照试剂说明书的要求，操作完成后封片即刻在光学显微镜下观察和计数,表达β?半乳糖苷酶活性的地方呈蓝色，每组取3张切片，每张切片随机观察3个视野，计算视野中每100个细胞中阳性细胞率。

　　1.6  统计学方法

　　资料分析采用SPSS11.0统计软件完成。计量资料描述采用x±s，组间比较行单因素方差分析，组间多重比较用SNK?q检验。

　　2  结果代理发表论文

　　β?半乳糖苷酶检测显示胞浆呈深蓝色者为阳性细胞(图1)，表明细胞处于衰老状态。方差分析结果显示，预防性实验部分的组间β?半乳糖苷酶表达，M组衰老细胞数目多于N组和各预防性用药组，差异有统计学意义（P<0.01）；治疗性实验部分的组间β?半乳糖苷酶表达，用药各组与S?R组相比，衰老细胞数目明显减少（P<0.01），其中Tm组最低差异有统计学意义（P<0.01），见表1。表1  预防组及治疗组大鼠下颌下腺β?半乳糖苷酶的表达(略)

　　3  讨论

　　1995年，Dimiri等〔1〕发现体外培养的人二倍体成纤维细胞在pH为6时，β?半乳糖苷酶染色的阳性率随代龄增加而增加，因此他们把这种中性β?半乳糖苷酶，定义为衰老相关的β?半乳糖苷酶。并提出这种中性β? 半乳糖苷酶是一种很好的可用于体内外衰老研究的生物学标志。1999年，Pendergrass〔2〕对不同年龄恒河猴的皮肤组织切片进行衰老相关β?半乳糖苷酶染色检测，发现其阳性率有随龄增加的趋势。本研究应用冰冻切片检测β?半乳糖苷酶在下颌下腺表达的改变。发现HSWY作用后，与模型组相比，衰老细胞数目明显减少，延缓了衰老细胞群体死亡的发生，从而延长了细胞的生存时间。

　　传统的中医学认为，脾肾亏虚夹瘀是衰老的基本病机，作用于衰老的全部过程，因而以补肾健脾，活血化瘀为治法预防及延缓衰老，标本兼治，使补正不敛邪，祛邪不伤正，从而达到防衰老的效果。HSWY由《宣明论方》何首乌正丸加味而成，正是通过补肾（炙何首乌、怀牛膝、肉苁蓉、淫羊藿），补脾（茯苓），活血化瘀（丹参）药物而达到补肝肾、兼健脾活血化瘀、延年益寿之功效〔3，4〕。医学研究表明，HSWY配方中的6味草药均为常用的抗衰老药物，具有明显的抗衰老作用，本实验结果亦证实其具有抗下颌下腺细胞衰老的作用，但尚不能解释其机制。

　　参考文献： 

 　　1 Dimiri GP，Lee X，Basile G，et al.A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1995；92（1）：93?6.代理发表论文

　　2 Pendergrass WR，Lane MA，Bodkin NL,et al.Cellular proliferation potential during aging and caloric restration in rhesus monkeys〔J〕.J Cell Phsiol，1999；180（1）：123?30.

　　3 谭颖然.何首乌的抗衰老作用机制探讨〔J〕.湖南中医药导报，2004；10（3）：73?4.

　　4 罗瑞芝，贾维，赵利斌，等.何首乌研究进展〔J〕.中草药，2005；36（7）：1097?100.