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　　摘要：魔芋（Amorphophallus Konjac）软腐病频发已成为制约魔芋种植业发展的瓶颈。目前对其病原、发病规律及防治方法等进行了一些研究，加深了对魔芋软腐病的认识，取得了一定进展，但对魔芋软腐病的侵染和发病机制缺乏系统而深入的研究。通过测定软腐菌（Pectobacterium carotovora subsp.carotovora）在魔芋根表吸附量和根部侵入量，研究不同温度、pH、接种浓度、LPS和EPS对软腐菌在魔芋苗根部吸附和侵入过程的影响。结果表明，软腐菌在魔芋苗根部吸附侵入的最适温度条件是30 ℃、pH 6.0，随接种浓度增加吸附和侵入量增加;菌体LPS是魔芋软腐欧文氏菌对寄主根表的吸附所不可缺少的成分，而EPS预处理对吸附侵入量影响较小。本研究明确不同外界因子（温度、pH、接种浓度）和细菌识别子（EPS和LPS）在软腐菌吸附识别魔芋根际中的作用，从源头上了解软腐菌对魔芋根系的侵染机制，为研究病害循环和制订防治策略提供新的启示，从根本上有效控制魔芋病害的发生，并为魔芋的抗病育种提供新思路。

　　关键词：魔芋（Amorphophallus Konjac）;软腐菌（Pectobacterium carotovora subsp.carotovora）;吸附;侵入

　　中图分类号：S792.39        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）23-5734-04

　　魔芋（Amorphophallus Konjac）是自然界中唯一高含葡甘聚糖的特种经济作物，其在食品、医药保健、工业材料等方面用途广泛[1]。随着加工产业的快速壮大，其种植面积也迅速扩大，据2013年中国魔芋产业发展研讨会统计，2013年全国魔芋种植面积已达 169.31 万亩。但在魔芋种植过程中，魔芋软腐病病原为软腐菌（Pectobacterium carotovora subsp.carotovora），一般减产20%～30%，严重的达80%，甚至绝收[2]。

　　自二十世纪八十年代发现魔芋软腐病以来，对其病原、发病规律及防治方法等进行了一些研究，加深了对软腐病的认识，取得了一定进展，但对魔芋软腐病的侵染和发病机制缺乏系统而深入的研究。很多学者根据软腐病菌的侵染特性，认为魔芋软腐病病原菌是从自然孔口和伤口侵入。Wu等[3]研究发现，在魔芋软腐病系统中，软腐菌可以通过魔芋根系的吸附侵入，导致病害的发生。

　　病原细菌与寄主植物在根系的相互作用包括一系列的连续反应，由接触、吸附到定殖及其间的相互识别，然后侵人并潜伏，最后导致寄主发病[4]。因此，研究软腐病如何识别、吸附、侵染根系的机理，对确定生产中防治重点有重要意义。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　Pectobacterium carotovora subsp.carotovora为湖北省农业科学院经济作物研究所实验室保存（Genbank注册号FJ463871）。魔芋组培苗由湖北省农业科学院经济作物研究所实验室提供，高度6～8 cm，生根15～20 d，根长约2 cm。

　　1.2  试验方法

　　1.2.1  菌种制备  将供试菌株在NA培养基30 ℃培养24 h，用无菌水配制成细菌悬浮液，稀释平板计数，备用。

　　1.2.2  不同温度条件下软腐菌在魔芋根表吸附量和根部侵入量测定 取配好的浓度为6×107个/mL细菌悬浮液50 mL装入250 mL培养瓶中，分别置于15、20、25、30、35℃的光照培养箱内，待菌悬液的温度与培养箱内温度一致后，将魔芋苗放入其中，根部完全浸没到悬浮液中，每组处理3棵魔芋苗，在浸根接种后0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 h分别剪取幼根，测定不同温度条件下软腐菌根表吸附量和根部侵入量。设3次重复，结果取平均值，利用Excel进行数据处理。

　　1.2.3  不同pH条件下软腐菌在魔芋根表吸附量和根部侵入量测定  用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH将无菌水pH调节为5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，分别配制成浓度为6×107个/mL的细菌悬浮液，然后取50 mL相应值的细菌悬浮液放入250 mL培养瓶中，将魔芋苗放入其中，根部完全浸没到悬浮液中，每组处理3棵魔芋苗，置于30 ℃的光照培养箱内，在浸根接种后0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 h分别剪取幼根，测定不同pH条件下软腐菌根表吸附量和根部侵入量。设3次重复，结果取平均值，利用Excel进行数据处理农业科学。

　　1.2.4  不同接种浓度下软腐菌在魔芋根表吸附量和根部侵入量测定  用无菌水分别配制浓度为6×104、6×105、6×106、6×107、6×108个/mL的细菌悬浮液，取50 mL相应值的细菌悬浮液放入250 mL培养瓶中，将魔芋苗放入其中，根部完全浸没到悬浮液中，每个处理3棵魔芋苗，置于30 ℃的光照培养箱内，在浸根接种后0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 h分别剪取幼根，测定不同接种浓度条件下软腐菌根表吸附量和根部侵入量。设3次重复，结果取平均值，利用Excel进行数据处理。

　　1.2.5  LPS和EPS的吸附和抑制试验  取6×108个/mL浓度细菌悬浮液1 mL加入1 000 mL NA液体培养基，在30 ℃，200 r/min条件下培养18 h，按Baker 等的酚水法提取LPS[5]。按Husain酒精沉淀法提取EPS[6]。参照董汉松等[7]的方法，用LPS和EPS分别对幼苗进行浸根处理，以无菌水作为对照，30 ℃条件下，30 min 后用pH 7.0细菌悬浮液（6×108个/mL） 接种，以不做预处理的接种为对照。30 ℃ 测定幼苗接种1 h 和6 h 后软腐菌对根表吸附量和根部侵入量。设3次重复，结果取平均值，利用Excel进行数据处理。 

　　1.2.6  EPS和LPS对菌体的吸附和抑制试验  无EPS和无EPS及LPS菌体悬浮液制备参考董汉松等[7]的方法。分别用浓度为6×108个/mL无EPS及无EPS及LPS的细菌悬浮液处理魔芋苗，以未处理6×108个/mL的细菌悬浮液处理魔芋苗。30 ℃ 测定幼苗接种1 h 和6 h 后软腐菌对根表吸附量和根部侵入量。设3次重复，结果取平均值，利用Excel进行数据处理。

　　1.2.7  根表吸附量和根部侵入量测定方法及根表吸附量测定[8]  每株每次剪取1条幼根，距离幼根末端约2 cm，将截取的根尖浸入5 mL无菌水中，涤荡1 min后，取出根尖，用灭菌滤纸吸干外表水分，称质量，用稀释平板法统计悬浮液中的细菌数量，即为软腐菌的根表吸附量。根部侵入量测定[8]：将称重后的根尖放入5 mL无菌水中，磨碎，用平板计数法计数悬浮液中的细菌数量，即为软腐菌的根部侵入量，计算公式为：吸附或侵入量（个/g鲜质量）=细菌浓度（个/mL）×分离用水量（mL）/根质量（g鲜质量）。

　　2  结果与分析

　　2.1  温度对软腐菌在魔芋苗根部吸附侵入的影响