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摘要：采用ＩＳＳＲ分子标记技术对云南省大姚县、瑞丽市和四川省木里县的４１株野生香菇（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａｅｄｏｄｅｓ）菌株进行ＤＮＡ聚类分析，利用ＮＴＳＹＳ软件对其遗传多样性进行聚类分析。结果表明，利用１８个引物对４１个野生香菇菌株的ＤＮＡ进行ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增，共扩增出１６２条清晰的ＤＮＡ片段。聚类分析结果表明，相似水平在６２％左右时，４１株野生香菇菌株分为３个类群，各地香菇资源存在较丰富的遗传多样性且与地域无明显相关性。

 

　　关键词：香菇（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａｅｄｏｄｅｓ）；ＩＳＳＲ；遗传多样性；ＤＮＡ聚类分析

 

　　香菇（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａｅｄｏｄｅｓ）是一种可食用的大型木腐担子菌［１］，具有较高的营养价值和药用价值。含有高蛋白、多糖、低脂肪等诸多的营养［２，３］，这使得香菇成为世界上产业发展速度最快的菇类［３］。我国幅员辽阔、气候复杂、地形多变、香菇野生品种繁多，但是由于分化程度低、形态差异小，要以形态特征为依据难以对品种进行有效鉴定；栽培规模的迅速扩大和自然生境的逐渐减少，迫切需要加快香菇种质资源的研究，加紧对野生香菇进行遗传多样性研究。

 

　　ＩＳＳＲ分子标记技术（Ｉｎｔｅｒ－ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ，ＩＳＳＲ）于１９９４年由Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ等［４］提出，利用在真核生物基因组中经常出现的简单重复序列本身来设计引物进行ＰＣＲ扩增［５］。ＩＳＳＲ分子标记己应用于研究植物种内遗传变异、种间遗传变异［６］、品种鉴定［７，８］、遗传作图［９］和居群遗传学［１０］等研究中，在遗传多样性和亲缘关系［１１］研究中的应用更为广泛。本研究利用ＩＳＳＲ分子标记技术对西南地区的云南省瑞丽市、大姚县和四川省木里县的野生香菇进行了遗传多样性分析，以期能客观反映香菇属真菌的亲缘关系和地理变迁情况。

 

　　１材料与方法

 

　　１．１供试菌株

 

　　供试４１个香菇菌株的编号、采集地点等详见表１。

 

　　１．２方法和步骤

 

　　１．２．１基因组ＤＮＡ的提取将低温保存的４１个野生香菇菌种接种于ＰＤＡ斜面培养基上，２６℃培养７～１０ｄ。活化后用接种针挑取试管斜面培养基上边缘处生长较旺盛的菌块，接种到液体培养基中，于室温下静置培养１个月后，用滤纸收集香菇菌丝体，用吸水纸吸干，参照ＣＴＡＢ法［１２］并作改良以提取其ＤＮＡ，于－２０℃保存备用。

 

　　１．２．２ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增扩增反应的体系为１５μＬ，包含ＰＣＲ缓冲液１．５μＬ、２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２１．２μＬ、２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ１．２μＬ、１０μｍｏｌ／Ｌ引物０．３μＬ、Ｅｘ－ＴａｑＤＮＡ聚合酶（大连宝生物工程有限公司）０．０７５μＬ、０．００１μｇ／ｍＬ模板１μＬ，最后用去离子水将总体积补至１５μＬ。

 

　　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应程序为：９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，４８～５５℃范围内退火３０ｓ，７２℃延伸１０８ｓ，３３个循环；最后７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃保存。

 

　　１）引物筛选。以４１株野生香菇菌株为ＤＮＡ模板，通过ＴＭ值比较，对Ｐ１～Ｐ２７号引物进行分组和初筛选，ＴＭ值相近的为一组，筛选出清晰、重复性好、多态性高的ＰＣＲ扩增引物。

 

　　２）ＩＳＳＲ－ＰＣＲ条件优化。由于ＩＳＳＲ标记易受ＰＣＲ条件的影响，因此需对ＰＣＲ扩增反应进行优化。

 

　　退火温度的优化：使用引物Ｐ１４和Ｐ２０对８１０４菌株模板进行ＰＣＲ扩增，筛选最佳退火温度。扩增反应在梯度ＰＣＲ仪（Ｂｉｏ－ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ公司）上进行，设最小温度为４７．３℃，最大温度为５５．３℃，自动形成８个温度梯度，分别为５５．３、５４．９、５４．０、５２．４、５０．５、４８．９、４７．９、４７．３℃。

 

　　镁离子浓度的优化：使用引物Ｐ１４对８１０４菌株模板进行ＰＣＲ扩增来优化镁离子浓度，Ｍｇ２＋浓度的优化范围为１．６～２．５ｍｍｏｌ／Ｌ（即ＭｇＣｌ２的用量为０．９６～１．５μＬ），Ｍｇ２＋浓度设１０个梯度，分别为１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ。

 

　　３）ＰＣＲ扩增及产物检测。用优化后的反应体系（表２）和筛选出来的１８个引物（表３）进行ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ扩增后，取４μＬ的ＰＣＲ扩增产物加少量６×Ｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ，于浓度为１．０％的琼脂糖凝胶（含０．５μｇ／ｍＬ的ＥＢ）上电泳，并于ＢＩＯＲＡＤＧｅｌＤｏｃＴＭＸＲ＋凝胶成像系统成像。

 

　　１．２．３数据分析利用凝胶系统成像软件把条带信息转化为０－１矩阵。即对所有引物的电泳条带进行记录，在相同位置出现条带的记为１，无条带的记为０。然后采用ＮＴＳＹＳ软件进行遗传相似性聚类分析，绘制树状聚类图。

 

　　２结果与分析

 

　　２．１ＤＮＡ的提取

 

　　将所采４１个野生香菇菌株用ＣＴＡＢ法进行ＤＮＡ的提取，结果见图１。如图１所示，得到的野生香菇菌株ＤＮＡ约２３１３０ｂｐ，且ＤＮＡ电泳条带清晰，ＤＮＡ的纯度、浓度及产率都比较高，无降解，适用于ＩＳＳＲ分子标记分析。

 

　　２．２ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增结果

 

　　用筛选得到的１８个引物对所有供试菌株进行ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增，扩增产物用１．０％的琼脂糖凝胶电泳检测，所测结果见图２、３。如图２、３所示，可以看到同一引物对不同的香菇菌株扩增后所得到的ＤＮＡ条带清晰度和多态性均很高，说明所建立的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系适合野生香菇菌株的ＰＣＲ扩增，可用于遗传多样性分析。经统计，１８个引物对４１个野生香菇菌株扩增后，共检测到１６２条条带，多态性条带为１６２条，多态率为１００％。

 

　　２．３聚类分析结果

 

　　根据ＩＳＳＲ－ＰＣＲ分析结果，采用ＮＴＳＹＳ软件进行聚类分析，得到４１个野生香菇菌株的ＩＳＳＲ聚类分析图（图４），供试的４１个野生香菇菌株相似系数为０．６０～０．８５。其中８０４１和８０４３号野生香菇菌株的相似系数达到了０．８５以上，说明它们的遗传背景极为相似，而且两者的采集地都来自云南省大姚县，因此可能是相同的菌株，存在同物异名的可能性。在相似系数０．６２左右，４１个野生香菇菌株可以分为三大类，其中８１２７、８１１０、８１３５号３个野生香菇菌株聚为一类（Ⅲ），都来源于四川省木里县，８１１０号野生香菇来自于木里县列瓦乡三村，８１２７和８１３５号野生香菇都来自木里县集市；聚为第二类（Ⅱ）的菌株有４个：８０８０、８０７７、８１３９、８０７９号野生香菇菌株，除了８１３９号野生香菇来自四川省木里县集市，其余３个均来自云南省瑞丽市；其他３４个野生香菇菌株聚为第一类（Ⅰ），其中云南省的香菇有９个，四川省的香菇有２５个，说明这些菌株的遗传背景相似，亲缘关系比较近。

 

　　聚类结果还表明，地理位置来源相同的野生香菇菌株分布在不同的ＩＳＳＲ聚类中，比如第一类中包含了来自木里县、大姚县和瑞丽市的菌株，反映出这３个地方的菌株不同地理群体间差异不大，而第二类中包含了瑞丽市和木里县的菌株，和第一类情况相同，说明ＩＳＳＲ聚类分析与菌株的不同地理来源之间无明显的相关性。

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