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　　1.5.2  菌丝浓度测定  Eppendorf 台式离心机5 000 r/min离心10 min。

　　1.5.3  芽孢数测定  活菌数按常规平板计数法测定[5]，检测芽孢数前，将菌液在80 ℃预处理20 min，再按照常规平板计数法测定[6，7]。

　　1.5.4  抗生素含量测定  首先将发酵液直接冻干成粉末，采用甲醇萃取，萃取液采用HPLC测定，条件：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为0.01 mol/L三氟乙酸-乙腈，从77.0%～75.5%二元梯度洗脱;流速为1.0 mL/min;紫外检测波长为205 nm;进样量为20 μL;柱温为30 ℃。

　　2  结果与分析

　　2.1  多粘芽孢杆菌临界氧浓度的确定

　　多粘芽孢杆菌菌体浓度进入稳定期之后，突然停止通气，观察溶氧电极指数的变化。由图1可知，刚开始溶氧直线下降，而当其降到约20%时，下降速率变小。这说明溶氧为20%以下时，多粘芽孢杆菌的呼吸会受到影响，也表明该菌是一个极度高耗氧微生物，溶氧对其影响非常大，20%的溶解氧浓度是该菌的生长临界溶解氧浓度。

　　2.2  不同溶氧下多粘芽孢杆菌发酵的动力学特征

　　图2表明刚开始接种的15 h内，发酵液中溶氧浓度较高，有利于菌体的生长。随着发酵时间的延长，过高溶氧浓度并不利于多粘芽孢杆菌菌体的生长。数据显示最佳溶氧是40%，该条件下菌体浓度可以达到最高，为42%。而由图3可知，不同溶解氧浓度也影响几种代谢产物多粘菌素和杀镰孢菌素等的生成速率及最终发酵液中它们的含量。图3显示溶氧为40%的情况下抑菌物质生成速率均要大于其他两个溶氧浓度下的生成速率，并且该溶氧条件下抑菌物质的最终浓度要大于其他条件下的最终浓度。 

　　2.3  不同溶氧下多粘芽孢杆菌芽孢形成的比较

　　这里考察了不同溶氧对多粘芽孢杆菌芽孢形成的影响，当42 h发酵结束时，测定芽孢数，计算芽孢形成率。从表1中可以得知，当溶氧为40%时，芽孢形成率最高，同时由于该条件下菌体浓度最高，所以形成的芽孢数也是最多的。

　　2.4  利用补料技术控制多粘芽孢杆菌发酵过程中的溶氧

　　由于前面试验已经证明了该菌是一个极度高耗氧微生物，而在分批的情况下碳源已经全部加入了培养基，这就导致分批发酵时的溶氧不会很好，只能在非常高的转速下（700 r/min以上）才能达到比较好的溶氧效果，但是这样的培养条件不利于放大。为此笔者采用补料分批的方法流加碳源， 以提高发酵过程中的溶氧， 达到提高芽孢数和抑菌物质产量的目的。当溶氧上升时开始补料，灵活的控制补料速率保存溶氧在40%波动， 结果（表2）表明补料发酵确实能提高产品的芽孢数和生物活性物质的产量。

　　3  小结与讨论

　　多粘芽孢杆菌在自然环境中栖息广泛，不仅常见于土壤、植物体表以及植物的根、低茎等部位，而且是常见的植物内生细菌。由于具有良好的抗生作用、溶菌作用、诱导抗性和促生作用等，研究人员将其作为生物农药或者生物肥料施用于大田中，均反馈产生了较好的效果，这促使了相当多的研究机构和厂家关注以及研究该菌[8，9]。但是由于多粘芽孢杆菌比较难形成芽孢以及产素水平较低，市场上较难见到产品。研究了溶氧对于多粘芽孢杆菌发酵的影响，发现过高或者过低的溶氧都不利于其形成芽孢和产素，只有在溶氧为40%时，发酵水平才能达到最高。为达到该目的，后面又进行了通过补料技术控制溶氧的试验，结果表明补料能较好的提高多粘芽孢杆菌的芽孢数和抑菌物质产量，分别达到15×109个/g和1.5%，以上研究结果为后面的工业化打下了良好的基础。

　　参考文献：

　　[1] 郭兴华.益生菌基础与应用[M].北京：科学技术出版社，2002.

　　[2] 顾觉奋.抗生素[M].上海：上海科学技术出版社，2001.

　　[3] 俞俊棠.生物工艺学[M].北京：化学工业出版社，2003.