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　　摘 要：实验以抗稻瘟病链霉菌JK-1的基因组DNA为材料构建了其BAC（bacterial artificial chromosome）文库。该文库共有3 456个克隆，插入片段在40～100kb，平均插入片段55kb，空载率低于5%，覆盖了链霉菌基因组约17.3倍。抗稻瘟病链霉菌JK-1基因组BAC文库的构建，为进一步研究基因组结构及其功能基因的利用等奠定了基础。

 

　　关键词：链霉菌；BAC文库；基因组

 

　　中图分类号 S435.111 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）24-17-03

 

　　放线菌聚酮合酶基因（polyketide synthase genes，PKSs）合成的聚酮化合物具有广谱生物活性，表现出抗细菌、抗真菌、抗癌、治疗心血管疾病、降低胆固醇等效果[1]。放线菌中最重要的成员链霉菌，其产生的聚酮化合物占人类医用抗生素的60%以上[2]。在过去的几十年里，许多聚酮生物合成途径中的重要基因已被克隆并被异源表达[3-5]。

 

　　近年来，本实验室从蓝花鼠尾草（Salvia farinacea）中分离到一株内生链霉菌JK-1，其次生代谢产物经平板生测实验表明，对稻瘟病菌的抑制率达99%以上。次生代谢产物经质谱分析表明，活性物质属于七烯类化合物，该化合物在化学结构数据库中没有相应的结构，属于一种全新的聚酮化合物。因此本项目试图将本实验室发现的这株链霉菌JK-1基因组中的多烯类聚酮合成酶基因/簇通过构建基因组BAC（Bacterial artificial chromosome）文库的方法克隆出来，并进行生物信息学分析和功能预测，为抗水稻稻瘟病提供新的抗性基因。

 

　　1 材料与方法

 

　　1.1 实验材料 链霉菌JK-1由本实验室保存，该菌自蓝花鼠尾草（Salvia farinacea）（于2008年采自中国科学院武汉植物园）内分离得到，其孢子的甘油悬浮液于-80℃保存备用。

 

　　1.2 实验方法

 

　　1.2.1 BAC载体的制备 克隆载体pHZAUBAC1[6]由华中农业大学罗美中教授惠赠。pHZAUBAC1质粒采用Qiagen plasmid midi kit提取，用农业科学BamHI（NEB）酶切，再用CIAP（NEB）酶脱磷酸化并进行自连反应，用脉冲电泳分离目的DNA片段pIndigoBAC36-S，用电洗脱法回收估测浓度，根据DNA的浓度加入甘油调整终浓度至25ng/μL，分装后于-80℃保存。

 

　　1.2.2 高分子量基因组DNA BamHI部分酶切产物的制备 链霉菌JK-1高纯度大分子量基因组DNA凝胶块（plug）的制备参照王万群的实验方法[7]。将制备好的plug做BamHI部分酶切，确定能产生50～150kb范围片段的内切酶用量。设0、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8共6个不同用量的BamHI酶浓度梯度，3/8的plug，冰上轻摇2h，然后30℃酶切10min。对酶切产物进行脉冲场凝胶电泳：1%琼脂糖凝胶，1×TAE，泵70，温度12℃，电压6V/cm，角度120°，脉冲时间0.1～40s，运行16h。根据电泳结果，确定最适内切酶用量。然后做大量酶切，经2次脉冲场电泳、电洗脱法分离纯化50～100kb和100～150kb间的DNA片段的凝胶块，用λDNA来定量所回收大片段DNA的浓度。

 

　　1.2.3 BAC文库的构建 回收的大片段DNA与载体按1∶1、5∶1、10∶1的比例进行连接，筛选最佳连接比例。连接产物用30%PEG8000透析，脱盐和浓缩。然后取2μL连接产物转化20μL感受态细胞ElectroMAX DH10B T1 Phage-Resistant（Epicentre公司），转化条件：1.25kV/cm，200Ω，25μF。转化产物中加入980μL的SOC培养基，37℃振荡培养1h，涂布LB平板（12.5μg/mL氯霉素、80μg/mL X-gal和100μg/mL IPTG），37℃倒置培养18h，通过蓝白斑筛选，鉴别可能的重组克隆[8]。挑取白色菌落，LB液体培养基37℃ 225r震荡培养18h，用BAC/PAC DNA Isolation kit（omegabiotek，US）提取BAC DNA，用I-SceI酶切检测插入片段大小和空载率。最后挑取白色克隆到含有70μL冻存培养基的384孔培养板里，37℃培养至培养基液变浑浊，用384针的Replicator将文库复制2份，一并贮存于-80℃低温冰箱保存。 

 

　　1.2.4 BAC文库的质量分析 从制备好的BAC文库中随机挑取100个克隆，用BAC/PAC DNA Isolation kit（omegabiotek，US）提取BAC DNA，用I-SceI酶切，脉冲电泳检测插入片段大小，脉冲条件：1%琼脂糖凝胶，1×TAE，泵70，温度12℃，电压6V/cm，角度120°，脉冲时间5～15s，运行15h。计算平均插入片段大小和空载率，估算全基因组覆盖度。

 

　　2 结果与分析

 

　　2.1 高分子量DNA制备与检测 本研究采用菌丝包埋法制备plug，制备好的plug经酶解释放DNA，蛋白酶K消化处理，脉冲电泳检测表明该方法提取的基因组DNA质量高，片段大，DNA降解少，完全能满足建库需求（图1）。

 

　　[M 1 2 3]

 

　　图1 链霉菌JK-1 HMW DNA脉冲电泳

 

　　注：M：Low range PFGE Marker（NEB产品）。1、2、3泳道为提取的基因组DNA。脉冲电泳条件：1%琼脂糖，1×TAE，8℃，泵70，角度120°，6v/cm，5～50s，16h。

 

　　2.2 基因组DNA酶切 酶切后脉冲结果显示，第4道的大部分片段集中在50～150kb，所以1/3的plug所用酶量在1.2U和2.4U最佳（图2）。以此为基础进行大量酶切，回收50～100kb及100～150kb的片段。

 

　　[M 1 2 3 4 5 6]

 

　　图2 链霉菌JK-1 HMW DNA的BamHI不完全酶切