论文投稿_医学论文投稿_核心期刊,职称论文投稿发表_论文部落

　　注：M：Low range PFGE Marker（NEB产品）。1～6泳道为1/3 plug分别为0，0.3U，0.6U，1.2U，2.4U，3.6U的BamHI于30℃酶切10min的结果。脉冲电泳条件为：1%琼脂糖，1×TAE，8℃，泵70，角度120°，6v/cm，0.1～40s，16h。

 

　　2.3 大片段选择回收 本实验用1.2U BamHI对plug进行了大量酶切，然后用脉冲场电泳分离，切下50～150kb的大片段，再分割成50～100kb、100～150kb的2个胶块，进行第2次片段选择。经过2次选择，有效地去除了较小的片段。

 

　　2.4 连接与转化 电泳结果显示本实验的载体质量高纯度好。本实验设置了片段与载体1∶1、5∶1、10∶1这3个梯度连接比例。结果显示，在5∶1的比例下，长出的克隆数目明显多于其它连接比例。连接后的产物经偷袭除盐处理以提高转化效率。

 

　　2.5 BAC文库质量检测 随机挑取100个克隆，接种到5mL含有12.5μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃ 240r/min培养12h，用BAC/PAC DNA Isolation kit（omegabiotek，US）提取BAC DNA，I-SceI酶切检测插入片段的大小。统计结果显示插入判断长度集中于50～100kb，平均大小55kb，文库空载率低于5%（图3）。链霉菌基因组大小约10M。本文库共有3 456个克隆，覆盖了链霉菌JK-1基因组至少17.3倍。

 

　　[M1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13]

 

　　图3 随机挑取13个链霉菌JK-1 BAC克隆的I-SceI酶切片段大小图谱

 

　　注：M：Low range PFG Marke（NEB产品），1～13泳道为BAC克隆的I-SceI酶切结果。脉冲电泳条件为：1%琼脂糖，1×TAE，8℃，泵70，角度120°，6v/cm，5～15s，16h。 （下转129页）

 

　　（上接18页）3 讨论

 

　　本文所用的BAC载体pCUGIBAC1由pIndigoBAC536和pGEM-4Z 2个载体连接而成，该载体综合了传统BAC载体稳定性好和链霉菌整合型载体的优势，完全满足了本实验的要求。在制备高质量DNA时是将菌丝体先包埋到低熔点琼脂糖之后，再用1mg/mL的溶菌酶消化菌丝体释放DNA，该方法规避了链霉菌基因组DNA容易被氧化而发生降解的缺点。制备好的基因组DNA经脉冲电泳二次回收选择，去除了中小片段等杂质片段的干扰，使得回收片段长度均一，从而有效提高了连接效率和转化效率。

 

　　连接产物的脱盐浓缩有助于提高转化效率。而最佳的连接效率往往需要进行载体与外源片段不同摩尔比的预连接实验[9]。经过摸索发现，载体与外源片段在1∶5比例下，连接效率最高。

 

　　本实验所构建BAC文库克隆总数达3 456个，容量为链霉菌基因组DNA含量的17.3倍，平均插入片段达55kb，根据经验公式[10]计算，本文库得到任一基因的概率为99.99%，适合于单基因的克隆和分离。本文库的成功构建为进一步克隆链霉菌基因组重要功能基因提供了必备的物质平台。

 

　　参考文献

 

　　[1]Heia S.，Borgos S.E.F.，Sletta H.et al.Initiation of Polyene Macrolide Biosynthesis：Interplay between Polyketide Synthase Domains and Modules as Revealed via Domain Swapping，Mutagenesis，and Heterologous Complementation[J].Applied and Environmental Microbiology，2011，77（19）：6982-6990. 

 

　　[2]刘志恒，姜成林.放线菌现代生物学与生物技术[M].北京：科学出版社，2004.

 

　　[3]Wattanachaisaereekul S.，Lantz A.E.，Nielsen ML.，et al. Optimization of heterologous production of the polyketide 6-MSAS in Saccharomyces cerevisiae[J].Biotechnology and Bioengineering，2006，97（4）：893-900.

 

　　[4]Gagunashvili A.N.，Davidsson S.P.，Jonsson Z.O.，et al.Cloning and heterologus transcription of a polyketide synthase gene from the lichen Solorina crocea[J]. Mycological Research，2009：354-363.

 

　　[5]Yuzawa S.，Kim W.，Katz L.，et al.Heterologous production of polyketides by modular type I polyketide synthases in Escherichia coli.，2011，23：1-9.

 

　　[6]Shi X.，Zeng H.Y.，Xue Y.D.，et al. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange[J].Plant Methods，2011，7：33.

 

　　[7]王万群.武夷菌素产生菌CK-15细菌人工染色体（BAC）[D].北京：中国农业科学院，2008.

 

　　[8]Wu C.C.，Nimm akayala P.，Santos F.A.，et al. Construction and characterization of a soybean bacterial artificial chromosome library and use of multiple complementary libraries for genome physical mapping [J]. Theor Appl Genet，2004，109（5）：1041-1050.

 

　　[9]邱芳，金德敏.温敏核不育水稻5460S细菌人工染色体文库的构建和鉴定[J].中国科学：C辑，1999，29（5）：518-524.

 

　　[10]Peterson D.G.，Tomkins J.P.，Frisch D.A.，et al. Construction of plant bacterial artificial chromosome（BAC）libraries An illustrated guide [J]. Journal of Agricultural Genomics，2000，5：1-100.