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　　摘要：对海洋硅藻硝酸盐转运蛋白NAT3编码基因的单拷贝插入转基因水稻纯系进行荧光定量PCR检测，获得NAT3基因的超表达株系。NAT3超表达株系中硝酸还原酶基因OsNR1的转录较非转基因对照中花11显著增强。对超表达株系及对照中花11进行不同氮素浓度的培养和栽培试验。结果表明，在低氮培养基培养条件下，转NAT3基因水稻的幼苗干重较中花11高;在低氮盆栽条件下，转NAT3基因超表达株系的叶绿素含量、生物学产量和植株的含氮量均较相同氮素条件下的中花11高，说明NAT3基因超表达能提高转基因水稻在低氮条件下的氮素利用效率，促进水稻生长。

　　关键词：转基因水稻;硝酸盐转运蛋白;氮素利用效率

　　中图分类号：S511        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）23-5653-04

　　水稻是我国主要的粮食作物，种植面积占粮食作物总面积的27%，产量占粮食总产的44%[1]。长期以来，水稻育种多以高产、耐肥抗倒作为主要育种目标，因为追求高产导致氮肥施用量大幅度增加[2]。大量氮肥的使用不仅提高了水稻的种植成本，导致增产不增收，而且还带来水体硝酸盐污染的潜在危险，对生态环境和人类健康产生极为不利的影响[3]。由于氮肥利用率的下降，氮肥过量施用造成的环境负效应也越来越引起广泛关注[4-8]。因此，通过遗传改良提高水稻品种的氮素吸收利用能力，降低氮肥使用量是发展水稻生产急需解决的重要问题。

　　水稻根系对土壤中氮素的吸收是决定水稻氮素利用效率的前提。硝酸盐是植物可直接利用的主要氮源之一，植物对硝酸盐的吸收主要依靠硝酸盐转运蛋白完成。深海硅藻硝酸盐转运蛋白基因与氮具有高度亲和性，在低氮环境下转录水平显著升高，可使硅藻从硝酸盐浓度极低的海水中富集硝酸盐[9]。NAT3是刘昱辉等[10]从深海硅藻中克隆的一个硝酸盐转运蛋白基因，通过农杆菌介导的遗传转化方法，将NAT3基因导入水稻品种中花11，获得了NAT3基因的转基因植株[11]。本研究通过荧光定量PCR对转基因水稻中NAT3基因表达量进行分析，获得NAT3基因超表达纯系，并进一步通过不同氮浓度的培养基培养及盆栽试验，测定转基因水稻与对照受体材料中花11的生长量及植株含氮量，并分析NAT3基因的表达对转基因水稻的氮素利用率的影响，为应用转基因技术培育氮肥高效利用水稻提供理论依据。本研究对减少水稻生产中的氮肥施用量、节约水稻生产成本、降低环境污染、促进农业高效节能可持续发展具有重要意义。

　　1  材料与方法

　　1.1  试验材料

　　本试验转基因株系是以中花11为受体的转NAT3基因T4代单拷贝插入纯系[11]。非转基因水稻对照材料为中花11，由湖北省粮食作物种质创新与遗传改良重点实验室繁殖保存。

　　1.2  NAT3基因及硝酸还原酶基因OsNR1表达量的测定

　　取三叶一心期的水稻幼苗（包括根），利用Trizol试剂抽提总RNA，通过琼脂糖凝胶和紫外分光光度计测定RNA质量和浓度。取5 μg RNA反转录酶合成单链cDNA，采用Roche公司的定量检测试剂盒FastStart Universal SYBR Green Master （Rox）进行定量PCR分析，内标基因为actin基因。引物由Invitrogen中国公司合成。扩增体系25 μL，其中12.5 μL 2× qPCR Mix ，2.0 μL引物，2.5 μL反转录产物，8.0 μL ddH2O 。扩增程序为预变性95 ℃，10 min;95 ℃变性15 s， 58 ℃下退火20 s，72 ℃下延伸20 s， 40 次循环;72 ℃延伸5 min。采用ΔΔCT法进行结果处理。

　　1.3  不同氮浓度培养基上转NAT3基因水稻幼苗的生长状况测定

　　NAT3基因超表达株系及对照中花11的成熟胚经消毒后，于MS培养基上获得无菌苗，选取生长状况一致的幼苗，去除胚乳后移栽到1/2MS、1/4MS、1/8MS 3个不同氮浓度的培养基上（1/2MS、1/4MS、1/8MS表示MS培养基中大量元素中的氮素减半，其余成分不变）。每个处理种植5株，40 d后取样，测定各处理5个植株的整株干重。

　　1.4  转NAT3基因水稻盆栽试验

　　盆栽基土为含氮量低的黄棕壤，碱解氮含量74.57 mg/kg。晒干后称取8 kg/（盆·干土），分别按不同氮素处理加入相应的营养元素。盆栽试验氮肥处理浓度设计如表1所示，在施用相同磷、钾肥的基础上，设4个氮素处理，分别为全氮（1N）、1/3氮（1/3N）、1/6氮（1/6N）、不施N肥（0N，空白对照），分基肥、分蘖肥和抽穗肥三期施用。NAT3基因超表达株系及对照中花11种子在育秧盘中播种，至四叶一心时选取生长一致的幼苗移栽，每盆种植4株，每个氮素处理种植6盆。抽穗期取3盆植株进行叶片叶绿素含量。农业科学成熟后另外3盆收获整个植株（包括根系），烘干后测定生物学产量和含氮量。

　　1.5  叶绿素含量测定

　　抽穗期取倒二叶片，每个处理取3个叶片，每个叶片测定2次。参考文献[12]测定叶绿素含量。

　　1.6  水稻植株含氮量及生物学产量测定

　　收获转基因株系及对照水稻整个植株（包括根系），洗净烘干后称重待测。用凯氏定氮法测定植株含氮量。

　　2  结果与分析

　　2.1  转基因株系中NAT3基因及硝酸还原酶基因OsNR1的表达

　　不同转基因株系中NAT3和OsNR1基因的转录表达情况如图1所示。10个转基因株系中有8个株系的NAT3基因有不同程度的转录表达，其中T4-1、T4-2及T4-3的NAT3基因转录量较高，而株系T4-9、T4-10及非转基因对照中花11中无NAT3基因转录。OsNR1基因在株系T4-1、T4-2及T4-3中有较高的表达量，高于在其他转基因株系与中花11中的表达量。OsNR1基因在不同转基因株系中的表达趋势与NAT3基因的表达趋势基本一致。同中花11相比，株系T4-1、T4-2及T4-3中OsNR1的转录显著增强。结果说明，NAT3基因整合到水稻基因组中后，能够正常表达，而且其超表达促进了下游硝酸还原酶OsNR1基因的表达。选择NAT3和OsNR1基因表达量高的转基因株系T4-1、T4-2及T4-3进行后续试验研究。