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        [摘要]：【目的】建立适合于大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）致病性相关突变体的快速筛选体系，为突变库中与致病性相关突变体的系统筛选和鉴定提供技术支撑。【方法】棉花幼苗接种于5.0×104、5.0×105、5.0×106、5.0×107 和5.0×108 孢子/mL 的孢子悬浮液30 min，通过病情指数调查明确引起棉花黄萎病发生的病原菌浓度范围；对培养于培养瓶的大丽轮枝菌分别加入15、25、35 和45 mL 的灭菌水，利用血球计数板检测洗脱的孢子浓度，明确不同体积灭菌水对洗脱孢子悬浮液浓度的影响；以保存于96 孔板的突变体为单位，在培养皿上进行单孢分离并挑取单个孢子于培养瓶中扩繁培养，培养后于培养瓶中直接加入适宜体积灭菌水洗脱孢子，并将棉花幼苗直接置于含有孢子悬浮液的培养瓶中处理30 min，接种后继续培养14 d 并调查结果；致病性相关突变体的可靠性检验采用定量菌液蘸根接种法，每个突变体接种30 株棉花幼苗，3 个重复，孢子浓度为5.0×106 孢子/mL，每株棉花幼苗按接种5 mL 菌液计算，处理30 min，分别在第5、8、11 和14 天调查病情指数。【结果】明确了适合于大丽轮枝菌致病力快速鉴定的接种孢子浓度为＞5.0×105 孢子/mL；建立了大丽轮枝菌培养方法，单孢纯化培养5 d，培养瓶中扩大培养9 d，确定了快速定量制备孢子悬浮液的洗脱体积为25 mL，测试的20 个突变体的洗脱孢子浓度范围在（2.55±0.58）×106—（1.72±0.25）×107 孢子/mL；优化了单孢分离、扩大培养、孢子悬浮液制备、接种、继续培养和结果统计等环节，建立了大丽轮枝菌致病性快速鉴定流程，进一步统筹设计构建了大丽轮枝菌致病性相关突变体快速筛选体系；测试表明该体系1 人1 个循环共7 个流程可完成1 344 个突变体筛选，周期54 d，工作量为21 人日；采用定量菌液蘸根法重复验证结果，突变体致病力同样显著下降，与快速筛选体系的鉴定结果一致，表明该体系适用于大丽轮枝菌致病性相关突变体的快速筛选。【结论】通过棉花幼苗种植、突变体单孢分离、扩繁培养、孢子悬浮液制备、接种、结果统计等环节的优化和标准化，构建了适合于大丽轮枝菌致病性相关突变体的快速筛选体系，为后续致病相关基因的分离提供了技术支撑。
　　[关键词]：大丽轮枝菌；致病性相关突变体；致病性鉴定；快速筛选体系
      引言
   【研究意义】棉花黄萎病是由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）引起的世界性土传植物病害和棉花生产的头号病害，平均每年造成15%以上的产量损失，素有棉花“癌症”之称[1]。围绕大丽轮枝菌致病相关基因的筛选与功能鉴定已成为解析其复杂致病机理的主流方向，其中大丽轮枝菌T-DNA 随机插入突变体库的构建和筛选是重要手段之一。近年来，国内外已经成功构建了多个大丽轮枝菌的T-DNA 随机插入突变体库并筛选到部分致病相关基因[2-4]，但针对突变体库的系统筛选和鉴定工作尚未开展，因此建立快速高效的致病性鉴定方法具有重要意义。【前人研究进展】大丽轮枝菌致病机理极其复杂，涉及蛋白激酶、转录因子、效应子、细胞壁降解酶等复杂的基因调控网络[5]。近年来，应用基因组学、蛋白质组学、T-DNA 突变等技术筛选了多个与大丽轮枝菌致病相关的基因，如糖基转移酶基因[6]、强致病力大丽轮枝菌特异基因VdSSP1[7]、坏死和乙烯诱导蛋白VdNLP1和VdNLP2[8-10]、1 号生理小种的无毒基因Ave1[11]、分泌蛋白调控因子VdSge1[12]、黏附转录激活因子Vta2[13]、小G 蛋白VdRac1[14]等。然而，大丽轮枝菌复杂的致病机理决定了需要数量庞大的致病相关基因参与，仅编码的分泌蛋白就超过800 个，其中221 个参与植物细胞壁降解[15-16]。因此，从全基因组层面系统鉴定大丽轮枝菌致病相关基因已成为揭示其致病机理的关键。农杆菌介导的T-DNA 随机插入突变是从全基因组层面分离新基因的有效方法，已在尖镰孢（Fusarium oxysporum）[17]、稻瘟病菌（Magnaportheoryzae）[18]和灰葡萄孢（Botrytis cinerea）[19]等植物病原真菌中成功应用。近年来，该技术也成功应用于大丽轮枝菌功能基因的筛选， 如莴苣黄萎病菌VdLs.17[2]、棉花大丽轮枝菌Vd991[3]、V592[4]等，并开展了致病性相关突变体的筛选研究。目前，大丽轮枝菌致病性鉴定的方法主要有病圃鉴定法[20]、针刺接菌法[21]、水培法[2,4]、纸钵撕底法[22]、无底塑钵菌液浇根法[23]、蛭石沙土无底纸钵定量蘸菌液法[24]、毒素鉴定法[25]等，其中应用于致病性相关突变体的筛选主要是定量蘸菌液法[22,24]和水培法[2,4]。定量蘸菌液法尽管可以用于大丽轮枝菌致病性相关突变体的批量筛选，但存在孢子浓度定量繁琐、接种苗数要求多、根系接菌不均一、鉴定结果周期长等问题；水培法虽然发病速率快，但同样存在孢子浓度定量繁琐、不易操作、易受其他杂菌污染等问题。以上这些因素导致筛选流程费时费力、鉴定周期长，严重制约了大丽轮枝菌致病性相关突变体的筛选研究。因此，建立适用于批量筛选大丽轮枝菌致病性相关突变体的体系已经成为分离致病相关基因的必要条件。【本研究切入点】传统大丽轮枝菌致病性的鉴定方法不适用于大规模大丽轮枝菌T-DNA 突变体的快速筛选。本研究以接种大丽轮枝菌孢子悬浮液浓度对棉花黄萎病发病的影响为切入点，通过对孢子悬浮液快速制备、接种孢子浓度、突变体培养、突变体致病性快速鉴定等环节的研究，建立大丽轮枝菌致病性相关突变体快速筛选体系。【拟解决的关键问题】明确引起棉花黄萎病的孢子接种浓度，建立标准化的大丽轮枝菌突变体培养方法，优化定量制备孢子悬浮液的条件，进而建立适用于批量筛选大丽轮枝菌致病性相关突变体的体系，为突变体库致病性相关突变体的系统筛选和致病相关基因的分离提供技术支撑。
　　1 材料与方法
　　试验于2013 年5 月至2014 年4 月在中国农业科学院农产品加工研究所完成。
　　1.1 材料
　　供试野生型菌株为来自棉花的大丽轮枝菌
　　Vd991；突变体来自笔者实验室构建的农杆菌介导的大丽轮枝菌T-DNA 随机插入突变体库[3,26]；供试棉花材料为高感棉花黄萎病的品种“军棉1 号”（Gossypiumhirsutum cv. Junmian 1）。
　　1.2 大丽轮枝菌的培养
　　采用标准培养瓶（Φ=60 mm，高85 mm）培养大丽轮枝菌。于培养瓶中加入约15 mL 的PDA 培养基（200 g·L-1 去皮马铃薯，20 g·L-1 蔗糖，18 g·L-1 琼脂粉），待培养基凝固后加入若干灭菌玻璃珠。于培养皿（Φ=60 mm）中对大丽轮枝菌进行单孢分离，挑取单菌落于培养瓶中并摇晃玻璃珠涂布均匀，25℃培养9 d。
　　于超低温冰箱中取出保存于96 孔板的大丽轮枝菌突变体菌株（15%甘油冻存），吸取20 μL 于含有PDA 培养基及灭菌玻璃珠的培养皿（Φ=60 mm）中，逐一对应编号，涂布后于25℃培养5 d 至长出单个菌落。用灭菌牙签一一对应挑取单个菌落于96 个含有PDA 培养基和灭菌玻璃珠的培养瓶中，摇晃玻璃珠均匀涂布后于25℃恒温箱中培养9 d。
　　1.3 棉花幼苗种植
　　培养土（营养土与蛭石按3﹕7 比例混合）装入底部带吸水孔的塑料白盘（310 mm×220 mm×60mm），离上沿约1.5 cm，适当平整后置于托盘中并注水，直至培养土表面湿润。取棉花种子均匀播种，随后覆盖培养土并在人工恒温气候室中培养15 d，28℃，光暗比14 h﹕10 h。
　　1.4 接种条件优化
　　于培养好的大丽轮枝菌培养瓶中加入适量的灭
　　菌水，摇晃洗脱分生孢子，采用血球计数板分别制备5.0×104、5.0×105、5.0×106、5.0×107、5.0×108孢子/mL 的孢子悬浮液。棉花幼苗轻轻拔出，去除土壤基质后将根系置于孢子悬浮液中处理30 min，期间准备若干打孔的纸钵（一次性纸杯，220 mL），培养土装至1/4 处，随后将接种的棉花幼苗移入纸钵中并覆盖培养土后，放在托盘内继续吸水至培养土表面湿润，然后置人工恒温气候室中继续培养，28℃，光暗比14 h﹕10 h，每个处理接种30 株棉花幼苗，3 个重复，清水为对照。接种后注意观察棉花发病情况，以确定引起棉花黄萎病发病的接种孢子浓度范围。
　　1.5 大丽轮枝菌孢子悬浮液的定量制备
　　按1.2 方法培养大丽轮枝菌Vd991，分别加入15、25、35 和45 mL 的灭菌水，设3 个重复，洗脱分生孢子后计算悬浮液的孢子浓度，并根据适合引起棉花黄萎病的孢子浓度范围，确定定量制备孢子悬浮液所需加入的灭菌水体积。随机选取20 个农杆菌介导的T-DNA 随机插入突变体菌株，按相同条件培养并加入上述确定的灭菌水量，制备孢子悬浮液并计数，检测定量制备孢子悬浮液的浓度范围。
　　制备突变体孢子悬浮液时，根据上述确定的定量制备孢子悬浮液所需加入的灭菌水体积，于培养瓶中逐一加入灭菌水并摇晃洗脱分生孢子，备用。
　　1.6 大丽轮枝菌致病性相关突变体筛选体系
　　突变体接种时，直接将棉株置于已洗脱孢子悬浮液的培养瓶中，处理30 min 后转移至含有1/4 体积培养土的纸钵中，随后覆盖培养土并转移至独立的塑料钵（Φ=70 mm，高100 mm），每个突变体接种5 株棉花幼苗，接种后置于人工恒温气候室中组培架（1 300mm×600 mm）上，每层均按96 孔板（12×8）的顺序布局，对照分别为接种野生型Vd991 和灭菌水，接种后避光培养2 d，随后28℃，光暗比14 h﹕10 h 条件下继续培养。接种14 d 后观察棉花发病情况，以野生型Vd991 接种的棉花幼苗的发病情况为参照，定性判断（或者定量统计发病株率、发病叶片率）并筛选致病力显著下降或者丧失的突变体。
　　根据突变体单孢纯化、培养、接种和致病性相关突变体筛选等环节，进一步优化整个接种流程，根据流程时间节点统筹设计，建立可标准化、流水线作业的大丽轮枝菌突变体高通量筛选循环。
　　1.7 致病性相关突变体检验
　　致病性相关突变体的可靠性检验采用定量菌液蘸根接种法，棉花幼苗于5.0×106 孢子/mL 的孢子悬浮液处理30 min，每个突变体接种30 株棉花幼苗，每棵苗按接种5 mL 菌液计算，野生型Vd991 为对照，灭菌水为空白对照，3 次重复。接种后于第5、8、11和14 天调查，病情指数计算参照国家标准《棉花抗病虫性评价技术规范—黄萎病GB/T22101.5-2009》。
　　2 结果
　　2.1 大丽轮枝菌孢子浓度对棉花黄萎病的影响
　　采用裸根蘸菌方法接种，在浓度为5.0×104 孢子/mL 条件下，接种14 d 后即表现出明显的黄萎病症状，病情指数为43.33，表现为强致病力，与Vd991 强致病力的表型相吻合；接种浓度为5.0×105 孢子/mL 时，棉花幼苗开始出现典型的黄化萎蔫和植株枯死症状，病情指数高达68.33；而当浓度大于5.0×106 孢子/mL时，接种棉花幼苗均萎蔫枯死，病情指数高于96.6（图1、表1）。结果表明，当接种大丽轮枝菌Vd991 浓度＞5.0×105 孢子/mL 时，即表现出严重的黄化萎蔫和植株枯死的症状，适合应用于大丽轮枝菌的致病性鉴定。