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　　2.2 大丽轮枝菌培养和孢子悬浮液制备的标准化研究建立了标准化的大丽轮枝菌培养流程，即用培养瓶培养大丽轮枝菌，便于直接进行大丽轮枝菌孢子洗脱和后续棉花幼苗蘸根处理。结果表明，甘油管菌株培养5 d 后即可长出约1 mm 的单菌落，单菌落转移到培养瓶中继续培养9 d 即可布满菌丝，扩繁出足量的菌丝体和孢子。制备孢子悬浮液时，加入15、25、35 和45 mL 的灭菌水洗脱孢子，浓度分别为（9.83±0.48）×106、（5.37±0.13）×106、（3.53±0.36）×106 和（2.18±0.18）×106 孢子/mL，其中加入25 mL 灭菌水制备的孢子悬浮浓度为（5.37±0.13）×106 孢子/mL，与接种棉花并表现为高致病力的孢子浓度5.0×106 孢子/mL 接近，孢子浓度适合接种棉花（图2-A）。随机选取20 个突变体进行培养，加入25 mL 灭菌水后制备的孢子悬浮液浓度范围在（2.55±0.58）×106—（1.72±0.25）×107孢子/mL（图2-B），均大于接种后表现为强致病力的孢子浓度（5.0×105 孢子/mL）。结果表明，在批量大丽轮枝菌培养和定量制备孢子悬浮液时，加入25 mL 灭菌水为最适宜的洗脱体积，制备的浓度大于5.0×105 孢子/mL，适合于后续大丽轮枝菌接种棉花幼苗。
　　2.3 大丽轮枝菌致病性相关突变体快速筛选体系在优化接种浓度和制备孢子悬浮液条件的基础上，构建了大丽轮枝菌致病性相关突变体快速筛选方法（图3）。单孢分离和培养：突变体培养5 d 后均能够完全活化并形成单个菌落，单菌落继续培养9 d 即长出致密菌丝，100%得到扩繁，该环节需0.5人日。孢子悬浮液制备和接种：加入25 mL 水悬浮孢子，同时将准备好的棉花幼苗直接置于培养瓶中接种，处理后转移至独立营养钵中继续培养，需要0.5 人日。致病性相关突变体筛选：根据野生型和水处理对照的病征表型，接种后14 d 统计结果，定性判断可以获得致病力显著下降或者完全丧失的突变体，定量标准可以统计棉苗株数（5 株）或者叶片（20 片）的发病率，该环节需要0.5 人日，整个流程从棉花幼苗培养开始到获得统计结果仅需30 d，其中实际工作量仅为1.5 人日，鉴定周期短，工作量小。
　　按上述流程进一步优化棉花幼苗种植、突变体单孢分离、扩繁培养、棉苗接种和结果统计等各个环节，结合时间节点和工作量，建立可连续循环的高通量大丽轮枝菌致病性相关突变体快速筛选体系（图4）。
　　该体系每个循环包含7 个流程，周期54 d，每天仅需开展1 项独立的环节，每个流程1 人可同时筛选2×96个突变体，单个循环可以完成1 344 个突变体，工作量仅为21 人日。应用该体系开展大规模致病性相关突变体筛选，以16 000 个突变体计算，两名科研人员264d（一年内）即可完成突变体库中致病性相关突变体的筛选。
　　2.4 大丽轮枝菌致病性相关突变体快速筛选体系的测试以本实验室构建的大丽轮枝菌T-DNA 随机插入突变体库为对象，对建立的筛选体系效率进行了测试。
　　结果表明，54 d 即完成了7 个流程，共计1 344 个突变的筛选鉴定，实际工作量与理论值21 人日一致。在筛选的突变体中，有69 个突变体致病力下降，其中16 个突变体致病力显著下降或丧失（图5），53 个突变体接种后棉花的叶片发病率低于50%，另外1 275个突变体致病力无变化或者下降不明显（叶片发病率高于75%）。结果说明，大丽轮枝菌致病性相关突变体快速筛选体系各个环节和流程的时间和工作量设计合理，筛选效率高，适合用于大丽轮枝菌T-DNA 随机插入突变库的高通量筛选。
　　2.5 筛选体系的可靠性验证
　　随机选取6 个应用上述筛选体系获得的致病力丧失或者显著下降的突变体，采用传统的定量菌液蘸根法进行致病力检测。结果表明，与野生型Vd991 的强致病力相比，致病性相关突变体对棉花幼苗群体仍表现为致病力丧失或者显著下降， 达极显著水平（P<0.01），其中01C06 和01E10 突变体致病力较对照菌株分别下降了86.01%和77.65%，病情指数与清水对照处理类似（表2），仅极少子叶因生理胁迫（接种时裸根处理）而表现出部分黄化症状。结果表明，本研究建立的大丽轮枝菌致病性相关突变体快速筛选体系结果可靠。
　　3 讨论
　　针对大丽轮枝菌致病相关基因的分离，已通过同源克隆、突变体筛选、基因组学、蛋白组学等技术开展了大量研究，初步明确了部分与致病相关的基因，如1 号生理小种的毒力基因Ave1[11]、黏附转录激活因子Vta2[13]、蔗糖非发酵蛋白激酶基因VdSNF1[27]、致病型相关分泌蛋白VdSSP1[7]等。然而，大丽轮枝菌致病机理及其复杂，涉及数量庞大的致病相关基因，如何系统分离和鉴定致病相关基因已成为研究热点。近年来，大丽轮枝菌基因组测序已经完成，并构建了莴苣黄萎病菌VdLs.17、棉花大丽轮枝菌Vd991 和V592等T-DNA 随机插入突变体库[2-4,28]，这为通过突变体库筛选致病性相关突变体并分离靶标基因提供了可能。
　　然而，通过大丽轮枝菌T-DNA 突变体库分离和
　　鉴定到的致病相关基因鲜有报道，莴苣黄萎病菌VdLs.17 的突变体库仅完成了181 个突变体的筛选，获得3 个致病相关基因[2]，针对棉花黄萎病菌致病相关突变体的筛选进展亦十分缓慢[28]，其主要的原因是尚未建立高效的大丽轮枝菌致病性快速鉴定方法。
　　当前，大丽轮枝菌致病性鉴定的方法主要有针刺接菌法[21]、纸钵撕底法[22]、无底塑料钵菌液浇根法[23]、毒素鉴定法[25]、水培法[2,4,28-29]等。但这些方法应用于突变体库的筛选存在3 个主要问题：一是接种时需要逐一定量测定突变体孢子浓度；二是根系接种不均一、发病周期长；三是接种要求苗数多、占用资源多。如蛭石沙土无底纸钵定量蘸菌液法尽管适用于准确鉴定某一菌株的致病力[24]，但应用于突变体库筛选时，定量测定孢子浓度、伤根接种不均一、接种苗数多、调查周期长（28 d）等因素限制了突变体库的高通量快速筛选。
　　鉴于此，本研究在传统方法的基础上，明确了大丽轮枝菌孢子浓度与棉花黄萎病发病程度的关系，确定引起棉花黄萎病的孢子悬浮液浓度范围为大于5.0×105 孢子/mL（图1），为突变体孢子悬浮液的快速定量制备提供了理论依据；进一步通过标准化培养大丽轮枝菌和孢子悬浮液洗脱方法，确定定性制备孢子悬浮液的洗脱体积为25 mL，批量测试的孢子浓度均满足接种要求（图2），解决了接种时需要逐一定量测定突变体孢子浓度的问题。接种方面，采用了棉花幼苗裸根浸泡于孢子悬浮液的方式，接种均一，发病周期短（仅需14 d），解决了根系接种不均一、发病周期长的问题。同时，建立的标准化方法每个突变体仅接种5 株棉花幼苗，结果统计简单易行，解决了接种要求苗数多、占用资源多的问题。由此建立了大丽轮枝菌致病性相关突变快速筛选体系（图3），该方法首选分别取20 μL 保存于96 孔板的甘油菌液于培养皿中涂布培养5 d 以分离单孢，随后挑取单孢于培养瓶中培养9 d，加入25 mL 的灭菌水洗脱孢子，并将准备好5 株棉花幼苗置于培养瓶中处理，接种后置于营养钵中继续培养14 d，调查统计结果。在此基础上，统筹棉花幼苗种植、突变体单孢分离、突变体培养、接种和结果统计等环节，建立了大丽轮枝菌致病性快速筛选体系。该体系是以保存于96 孔板的突变体为整体单位，规范了突变体培养、孢子悬浮液制备、接种、继续培养和调查统计流程，通过各个环节突变体一一对应操作和时间节点统筹设计，实现了大规模突变体的流水线鉴定。应用该体系，1 个循环7 个流程可以完成1 344 个突变体的筛选鉴定（图4），鉴定周期为54 d，其中工作量仅为21 人日，提高筛选效率和减少工作量均在10 倍以上。按笔者实验室16 000 个突变体库计算[26]，两名科研人员一年内即可完成突变体库中致病性相关突变体的筛选。
　　建立的筛选体系尽管解决了致病性相关突变体快速筛选的问题，但由于接种苗数较少，可能出现部分假阳性，这是由于在接种均一的前提下，棉花幼苗个体间对病原菌敏感性不一致和少量突变体悬浮液孢子浓度偏低（产孢能力受限的突变体）造成的。解决方法是将筛选出靶标突变体再次鉴定，以本研究鉴定的致病性相关突变体的比例（1 344 个突变体中69 个致病力显著下降）测算，16 000 个突变体约有800 多个致病力相关突变体，仅需不到1 个循环即可获得重复验证结果，提高筛选的准确性；或者采用定量菌液法验证致病下相关突变体的可靠性，如蛭石沙土无底纸钵定量蘸菌液法[24]。同时，应用本筛选体系还需注意两个问题：一是筛选致病力下降不明显的突变体准确性偏差，建议对获得的靶标突变体进行二次筛选验证；二是对于致病力增强的突变体需要通过观察发病进程的来判断，且最好选用耐或者抗病的品种作为鉴定材料。