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摘要：采用反复硅胶柱色谱法、ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０凝胶色谱法等分离纯化南海红树林内生真菌ＺＨ－７的代谢产物，并通过理化常数测定和光谱分析鉴定其化学结构。结果表明，从南海红树林内生真菌ＺＨ－７的培养液中分离得到６个代谢产物。经波谱解析，分别为：比卡菌素（１）、ｂｕｔｙｒｏｌａｃｔｏｎｅⅡ（２）、环（苯丙－脯）二肽（３）、环（苯丙－苯丙）二肽（４）、环（苯丙－缬）二肽（５）、环（苯丙－亮）二肽（６）。初步药理活性显示化合物１对口腔癌细胞ＫＢ，ＫＢｖ２００的抗肿瘤活性的ＩＣ５０值分别为１０．０和１４．５μｇ／ｍＬ。通过鉴定，所有化合物均首次从南海红树林内生真菌ＺＨ－７中分离得到。

 

　　关键词：红树林；内生真菌；代谢产物

 

　　中图分类号：Ｏ６２９文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０14）09－2061-03

 

　　MetabolitesofMangroveEndophyticFungusZH-7fromtheSouthChinaSea

 

　　ＹＡＮＧＪｉａｎ－ｘｉａｎｇ１，２，ＱＩＵＳｈｅｎｇ－ｘｉａｎｇ１，ＳＨＥＺｈｉ－ｇａｎｇ３，ＬＩＮＹｏｎｇ－ｃｈｅｎｇ３

 

　　（１．ＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＢｏｔａｎｉｃａｌＧａｒｄｅｎ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ／ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰｌａｎｔＲｅｓｏｕｒｃｅｓＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄＳｕｓｔａｉｎａｂｌｅＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６５０，Ｃｈｉｎａ；２．ＧｕｉｌｉｎＮｏｒｍａｌＣｏｌｌｅｇｅ，５４１００１，Ｇｕｉｌｉｎ，Ｃｈｉｎａ；

 

　　３．ＳｃｈｏｏｌｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｕｎＹａｔ－ｓｅｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０２７５，Ｃｈｉｎａ）

 

　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｃｏｍｐｏｕｎｄｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｂｙｃｏｌｕｍｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆｐｈｙｓｉｃ－ｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｎｓｔａｎｔｓａｎｄｓｐｅｃｔｒａｌａｎａｌｙｓｉｓｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｏｆｍａｎｇｒｏｖｅｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｕｓＮｏ·ＺＨ－７ｆｒｏｍｔｈｅＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＳｅａ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ６ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄａｎｄｅｌｕｃｉｄａｔｅｄａｓＢｉｋａｖｅｒｉｎ（１），ｂｕｔｙｒｏｌａｃｔｏｎｅⅡ（２），ｃｙｃｌｏ－（Ｐｈｅ－ｐｒｏ）（３），ｃｙｃｌｏ－（Ｐｈｅ－ｐｈｅ）（４），ｃｙｃｌｏ－（Ｐｈｅ－Ｖａｌ）（５），ｃｙｃｌｏ－（Ｐｈｅ－ｌｅｕ）（６）．Ｉｎｔｈｅｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｂｉｏａｓｓａｙ，ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ１ｓｈｏｗｅｄｓｔｒｏｎｇｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｏｎｔｈｅＫＢ，ＫＢｖ２００ｗｉｔｈＩＣ５０ｖａｌｕｅｓｏｆ１０．０ａｎｄ１４．５μｇ／ｍＬ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｌｌｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｗｅｒｅｆｉｒｓｔｌｙｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｕｓＮｏ·ＺＨ－７．

 

　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍａｎｇｒｏｖｅ；ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｕｎｇｕｓ；ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ

 

　　长期以来，国内外开发天然药物的重点一直集中在陆生生物资源，现有的天然药物大多数也都来自陆生生物。然而，在对陆生生物资源的长期研究开发过程中发现，从陆生生物次生代谢产物中发现新药或先导化合物的难度越来越大，抗性问题也日益严重，新药的开发面临着严峻挑战［１］。因此，自上世纪６０年代以来，人们开始将注意力投向尚未开发的巨大天然资源宝库——海洋微生物。海洋微生物生活在低温、缺氧、高压、高盐的特殊环境中，以其独特的代谢方式，提供了在陆地生物中没有的代谢产物。对海洋共生和附生微生物的研究是一个发现结构新颖、具有独特生理活性的化合物的重要途径。在目前许多深海远海海洋真菌都需要相对苛刻的条件，人们把目光投向了第二大海洋真菌的天堂——陆地海洋过渡生态系统红树林，而根据Bugni等［2］和Sadaba等［3］的研究发现绝大多数海洋真菌都与红树林有着紧密的联系。红树林内生真菌是一种新的天然产物资源，而且其化学成分也具有广泛的药理活性。如抗肿瘤及抗氧化活性［４，５］，抑制乙酰胆碱酯酶活性等［６－８］。

 

　　１材料与方法

 

　　１．１仪器和试剂

 

　　ＩＮＯＶＡ－５００ＮＢ型超导核磁共振谱仪和ＩＮＯＶＡ－３００ＮＢ型核磁共振仪（美国Ｖａｒｉａｎ公司），ＶＧＺＡＢ－ＨＳ型双聚焦质谱仪，ＴｈｅｒｍｏＤＳＱ型电子轰击电离质谱仪，ＴｈｅｒｍｏＭＡＴ９５ＸＰ型高分辨质谱仪，Ｘ－４型数字显示显微熔点测定仪（北京泰克仪器有限公司）。所用试剂均为广州化学试剂厂生产，化学纯，溶剂经重蒸后使用；柱层析硅胶为青岛海洋化工厂生产的２００～３００目硅胶，硅胶Ｈ，薄层硅胶ＧＦ２５４。

 

　　１．２菌种培养

 

　　红树林内生真菌ＺＨ－７采自中国广东省珠海市，经鉴定为拟茎点霉菌（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓｓｐ．），保存于中山大学化学与化学工程学院。发酵培养基为葡萄糖１０ｇ／Ｌ，蛋白胨２ｇ／Ｌ，酵母膏１ｇ／Ｌ，粗海盐２ｇ／Ｌ，ｐＨ７．０。５００ｍＬ三角瓶内装培养基２５０ｍＬ，１．２５×１０５Ｐａ灭菌３０ｍｉｎ后接种１２０ｍＬ，在２５℃静置培养３５ｄ。分别收集发酵液和菌体。

 

　　１．３提取与分离

 

　　１２０ｍＬ发酵物过滤得菌体和发酵液，发酵液浓缩后用乙酸乙酯充分萃取，菌体用甲醇多次浸泡。提取浓缩物分别以体积比１∶２拌硅胶（２００～３００目）进行柱层析，以石油醚／乙酸乙酯／甲醇进行梯度加压洗脱。收集各组分再经反复柱层析，制备薄层层析，重结晶等进行纯化。从培养液粗提物（约３０ｇ）中分离得到比卡菌素（１）（１２ｍｇ）、ｂｕｔｙｒｏｌａｃｔｏｎｅⅡ（２）（１３ｍｇ）、环（苯丙－脯）二肽（３）（１０ｍｇ）、环（苯丙－苯丙）二肽（４）（８ｍｇ）、环（苯丙－缬）二肽（５）（１０ｍｇ）、环（苯丙－亮）二肽（６）（１０ｍｇ）。

 

　　１．４细胞毒活性实验

 

　　采用ＭＴＴ法［９］测定了化合物１对人体口腔癌ＫＢ，ＫＢｖ２００的抗肿瘤活性。

 

　　１．５化合物的试验数据

 

　　化合物１：红色粉末。ＥＩＭＳ：３８２（基峰），３６７，３３９，３２５，３１１，２８３，２６９，２４１，２１２，１８４，７７，６９；１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，３００ＭＨｚ）δ：１３．２９（ｓ，ＯＨ），１２．７６（ｓ，ＯＨ），６．７９（ｄ，２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．９１（ｄ，２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．３４（ｓ，１Ｈ），３．９６（ｓ，３Ｈ），３．９４（ｓ，３Ｈ），２．８７（ｓ，３Ｈ）。

 

　　化合物２：淡黄色蜡状物。１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）：７．６８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８），７．００（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８），６．７３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４），６．６２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４），３．７７（ｓ，３Ｈ），３．５３（ｓ，２Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６）：１７２．４（Ｃ），１６９．８（Ｃ），１５９．７（Ｃ），１５８．０（Ｃ），１３９．８（Ｃ），１３３．６（２ＣＨ），１３１．１（２ＣＨ），１２９．５（Ｃ），１２５．８（Ｃ），１２３．５（Ｃ），１１７．６（２ＣＨ），１１６．４（２ＣＨ），８７．１（Ｃ），５４．７（ＣＨ３），４０．１（ＣＨ２）。ＥＩＭＳ（ｍ／ｚ）：３５６［Ｍ＋］。

 

　　化合物３：白色固体，熔点：１２４～１２６℃。１ＨＮＭＲ（氘代吡啶，３００Ｈｚ）δ：７．２４（５Ｈ，ｍ），４．６２（１Ｈ，ｂｒｓ），４．１３（１Ｈ，ｔ），３．６０（１Ｈ，ｍ），３．３２（２Ｈ，ｍ），２．１４（１Ｈ，ｍ），２．１３（１Ｈ，ｍ），１．７８（２Ｈ，ｍ）。１３ＣＮＭＲ（氘代吡啶，７５Ｈｚ）δ：１７０．３（Ｃ），１６５．１（Ｃ），１３６．０（ＣＨ），１２９．４（ＣＨ），１２９．１（ＣＨ），１２７．６（ＣＨ），５９．２（ＣＨ），５６．２（ＣＨ），４５．５（ＣＨ２），３６．９（ＣＨ２），２８．４（ＣＨ２），２２．５（ＣＨ２）。ＬＣＭＳ（ｍ／ｚ）：２４５［Ｍ＋１］＋。

 

　　化合物４：白色针晶，熔点：１２０～１２６℃。１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，３００ＭＨｚ）δ：７．９０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．２８（ｄｄ，７．５，７．０Ｈｚ，２Ｈ），７．２１（ｄｄ，７．５，７．０Ｈｚ，１Ｈ），７．０４（ｄ，７．０Ｈｚ，１Ｈ），３．９７（ｍ，１Ｈ），２．５７（ｄｄ，１３．５，７．０Ｈｚ，１Ｈ），２．２４（ｄｄ，１３．５，６．０Ｈｚ，１Ｈ）；ＦＡＢＭＳ（ｍ／ｚ）：２９５［Ｍ＋Ｈ］＋，２７９，１５６，１２０，８９，７７，５１。

 

　　化合物５：白色粉末，ＩＲ（ＫＢｒ）ｖｍａｘ：３２１０、３０３０、

 

　　１６６６、１６００、１４５０、７５６、７０２／ｃｍ；熔点：２８０～２８２℃。ＥＩＭＳ：２４６，２０４，１５５，１２７，９１（基峰）。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：８．０７（１Ｈ，ｓ），７．８８（１Ｈ，ｓ），７．２２（５Ｈ，ｍ），４．２０（１Ｈ，ｍ），３．５２（１Ｈ，ｍ），３．１４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．０，１３．５Ｈｚ），２．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．０，１３．４Ｈｚ），１．６９（１Ｈ，ｍ），０．６５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．２８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：１６６．５（Ｃ），５９．２（ＣＨ），３１．０（ＣＨ２），１８．２（ＣＨ），１６．２（ＣＨ３），１６６．４（Ｃ），５５．０（ＣＨ），３７．８（ＣＨ２），１３６．３（Ｃ），１３０．３（ＣＨ），１２７．９（ＣＨ），１２６．４（ＣＨ），１２７．９（ＣＨ），１３０．３（ＣＨ）。

 

　　化合物６：白色粉末，熔点：２６１～２６３°Ｃ。１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，３００ＭＨｚ）δ：７．２５（５Ｈ，ｍ），４．３０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．６Ｈｚ），３．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．２，１０．８Ｈｚ），３．６（１Ｈ，ｍ），２．９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．８，１３．６Ｈｚ），１．４１（１Ｈ，ｍ），０．８４（２Ｈ，ｍ），０．７２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），０．６７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）。１３ＣＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，７５ＭＨｚ）δ：１７０．６（ＣＯ），１６９．０（ＣＯ），１３６．８（Ｃ），１３１．８（ＣＨ），１２９．７（ＣＨ），１２８．５（ＣＨ），５７．５（ＣＨ），５４．２（ＣＨ），４５．３（ＣＨ２），４０．３（ＣＨ２），２４．７（ＣＨ），２３．３（ＣＨ３），２１．５（ＣＨ３）。

 

　　２结果与分析

 

　　化合物１～６的结构图如图１所示。

 

　　化合物１：红色粉末。１ＨＮＭＲ谱图比较简单，有两个螯合羟基１２．７６ｍｇ／Ｌ（ｓ，１Ｈ），１３．２９ｍｇ／Ｌ（ｓ，１Ｈ），两个间位耦合芳香质子６．９１ｍｇ／Ｌ（ｄ，２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７９ｍｇ／Ｌ（ｄ，２．４Ｈｚ，１Ｈ）和一个孤立芳香质子６．３４ｍｇ／Ｌ（ｓ，１Ｈ）以及3个甲基３．９ｍｇ／Ｌ（ｓ，３Ｈ），３．９４ｍｇ／Ｌ（ｓ，３Ｈ），２．８７ｍｇ／Ｌ（ｓ，３Ｈ）。１３ＣＮＭＲ显示有２０个碳。ＥＩＭＳ显示分子离子峰为３８２，结合１ＤＮＭＲ分析可推出该化合物的分子式为Ｃ２０Ｈ１４Ｏ８，参照文献［１０］可发现同已知化合物比卡菌素的谱图数据几乎一致，ＥＩＭＳ碎片离子峰完全一致，因此推测该化合物为比卡菌素。

 

　　化合物２：淡黄色蜡状物，ＥＩＭＳ显示化合物分子离子峰为３５６，结合核磁数据，可得化合物的分子式为Ｃ１９Ｈ１６Ｏ７。１３ＣＮＭＲ和ＤＥＰＴ显示两个对位取代的苯环，一个连氧叔碳，一个甲酸甲酯基，一个亚甲基，一个羧碳和一个双键。参照文献［１１］可确定化合物的结构为ｂｕｔｙｒｏｌａｃｔｏｎｅⅡ。该化合物是个木酯素类化合物，曾多次作为天然产物在多种真菌中被分离得到过。

 

　　化合物３：ＬＣＭＳ显示２４５［Ｍ＋１］＋，结合１Ｈ和１３ＣＮＭＲ，由此推定分子式为Ｃ１４Ｈ１６Ｎ２Ｏ２，不饱和度为８。１３ＣＮＭＲ和ＤＥＰＴ显示分子中含有１４个Ｃ，即４个ｓｐ３的－ＣＨ２，２个ｓｐ３的ＣＨ，５个ｓｐ２的ＣＨ，１个ｓｐ２的季Ｃ，２个－Ｃ＝Ｏ。氢谱δ４．６２（１Ｈ，ｂｒｓ）的一个活泼氢信号以及碳谱δ１７０．３和δ１６５．１处的两个酰胺碳信号，初步确定化合物３可能为环二肽化合物。δ７．２４（５Ｈ，ｍ）有一个单取代苯环，分子中没有甲基氢信号。一个苯环和一个环二肽的不饱和度为７，那么分子中另有一个环（不可能为一个双键）。参照文献［１２］可确定化合物３为环（苯丙－脯）二肽。

 

　　化合物４：白色针状晶体，溶解性能很差，ＴＬＣ碘熏显白点，拖尾。ＦＡＢＭＳ给出２９５［Ｍ＋Ｈ］＋，结合氢谱提示分子式为Ｃ１８Ｈ１８Ｎ２Ｏ２，不饱和度为１１。ＩＲ谱提示存在活泼氢信号［ν３１９０（ｂｒｓ）／ｃｍ］和羰基信号（ν１６６２／ｃｍ）。氢谱共给出９个质子信号，说明化合物是对称的。从氢谱［δ７．３１（ｔ，７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．２３（ｔ，７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１１（ｄ，７．５Ｈｚ，２Ｈ）］看出化合物存在一个单取代苯环，δ４．０５（ｍ，１Ｈ）是连杂原子的饱和次甲基质子信号，δ２．２３（ｄｄ，１３．５，７．５Ｈｚ，１Ｈ）和２．９２（ｄｄ，１３．５，４．５Ｈｚ，１Ｈ）是苄亚甲基质子的特征，δ７．０４（ｂｒｓ，１Ｈ）是活泼ＮＨ信号，据此推出该化合物为环（苯丙－苯丙）二肽。进一步与文献［１３］对比得到确证。

 

　　化合物５：白色粉末，ＩＲ（ＫＢｒ）ｖｍａｘ３２１０、１６６６／ｃｍ提示结构中含有酰胺键，３０３０、１６００、１４５０为芳环特征吸收峰，７５６、７０２提示取代类型为苯环单取代。ＥＩＭＳ给出分子离子峰为２４６。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）谱中显示，高场区有裂分为ｄ峰的２个甲基氢信号，推断结构中含有异丙基，在低场区δ７．２２（５Ｈ，ｍ）的１组氢信号提示结构中也含有单取代苯环，根据核磁数据与文献［１４］比对，鉴定化合物５为环（苯丙－缬）二肽。

 

　　化合物６：白色粉末，茚三酮显阴性，ＩＲ（ＫＢｒ）３３００，１６５０／ｃｍ提示结构中含有酰胺键，ＥＩＭＳ给出分子离子峰为２６０，结合１ＤＮＭＲ分析可以推出分子式为Ｃ１５Ｈ２０Ｎ２Ｏ２，比化合物５多一个ＣＨ２。１ＨＮＭＲ图谱中显示，高场区有裂分为ｄ峰的２个甲基氢信号，推断结构中含有异丙基，在低场区δ７．２２（５Ｈ，ｍ）的１组氢信号提示结构中也含有单取代苯环，根据化合物６的１ＨＮＭＲ和１３ＣＮＭＲ及其与文献［１５］对照确定化合物６为环（苯丙－亮）二肽。

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