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摘要：以野生金钗石斛（ＤｅｎｄｒｏｂｉｕｍｎｏｂｉｄｅＬｉｎｄｌ．）茎段为试验材料，筛选启动培养时的最佳取材部位、最适基本培养基、生根培养基与栽培基质，研究金钗石斛快速繁殖的途径。结果表明，启动培养时用金钗石斛幼茎基部接种，在ＭＳ＋６．０ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ＋０．２ｍｇ／ＬＮＡＡ＋１００ｍＬ／Ｌ椰乳＋２５ｇ／Ｌ蔗糖＋６．３ｇ／Ｌ琼脂的培养基上效果最好，诱芽率可达９３．００％。生根用ＭＳ＋６．０ｍｇ／ＬＮＡＡ＋０．５ｍｇ／ＬＩＢＡ＋１００ｇ／Ｌ香蕉＋２．０ｇ／Ｌ活性炭＋２５ｇ／Ｌ蔗糖＋６．３ｇ／Ｌ琼脂的培养基效果最好，生根率高达９５％。最优的组培苗栽培基质是水苔＋蛭石（３∶２，V∶V），成活率高达９０％。

 

　　关键词：金钗石斛（ＤｅｎｄｒｏｂｉｕｍｎｏｂｉｄｅＬｉｎｄｌ．）；快速繁殖；培养基；栽培基质

 

　　金钗石斛（ＤｅｎｄｒｏｂｉｕｍｎｏｂｉｄｅＬｉｎｄｌ．）属于兰科石斛属，是珍稀濒危植物［１］，具有生津益胃、润肺止咳、滋阴清热、明目强身等功效。现代药理研究表明，金钗石斛的水溶性多糖还具有抗辐射、防癌、抗肿瘤、减缓衰老、增强人体免疫力的作用，因而金钗石斛在治疗、预防疾病及保健食品中被广泛利用［２］。但是由于金钗石斛在野外对生境要求苛刻、分布狭窄、生长缓慢、繁殖系数极低、授粉率低、种子既小又无胚乳等原因［３］，在自然条件下正常发芽成苗率极低，加之长期过度采挖利用，使市场上金钗石斛货源极其短缺，导致其价格高昂。为了满足人们对金钗石斛的需求，迫切需要利用植物组织培养技术快速大量培育出优质组培苗，有效地解决种苗的需求；同时需要探索出一套成熟的金钗石斛栽培技术，大幅度提高金钗石斛的产量，这样既能满足中药材市场和保健食品领域的需求，又可达到对金钗石斛资源的保护、野生资源的可持续发展及推动农业、种植业经济发展的目的［４，５］。因此，近年来，许多学者对金钗石斛种子、茎尖、茎段组织培养技术进行了研究［５－７］，但大多数试管苗增殖系数低，试管苗茎细小、细弱，移栽成活率不高，影响了金钗石斛种苗快繁和大规模的工厂化生产。本试验对金钗石斛的幼茎组织培养进行研究，对基本培养基进行优化和改进，筛选最适启动培养基、生根培养基及栽培基质，探索金钗石斛快速繁殖的途径。

 

　　１材料与方法

 

　　１．１试验材料

 

　　供试材料为野生金钗石斛植株，来源于贵州省遵义市石笋乡山区，在平顶山学院低山丘陵区修复重点实验室的组织培养室人工栽入花盆中，栽培基质为珍珠岩：树皮：锯末=１∶１∶１（V∶V∶V，下同），栽培１０周后剪取幼茎作为试验材料，进行组织培养研究。

 

　　１．２试验方法

 

　　１．２．１启动培养在金钗石斛的启动培养中，对外植体的最佳取材部位、最合适的基本培养基和最理想的激素配比进行研究。

 

　　改良ＭＳ１和改良Ｂ５１两种基本培养基的制备：改良ＭＳ１配方为ＭＳ＋１００ｍＬ／Ｌ椰乳＋２５ｇ／Ｌ蔗糖＋６．３ｇ／Ｌ琼脂，ｐＨ５．６～５．８；改良Ｂ５１配方为Ｂ５＋１００ｍＬ／Ｌ椰乳＋２５ｇ／L蔗糖＋６．３ｇ／Ｌ琼脂，ｐＨ５．６～５．８。

 

　　以改良ＭＳ１和改良Ｂ５１为基础培养基，添加不同浓度的６－ＢＡ和ＮＡＡ，接种不同取材部位，设计１８个试验处理（表１），每个处理接种１０瓶。

 

　　１．２．２外植体灭菌和培养在生长健壮的盆栽金钗石斛母株上选择肥壮的当年生幼茎［８］，去掉叶和根，先用自来水冲洗１０ｍｉｎ后，在超净工作台上用无菌水漂洗３遍。将清洗干净的幼茎放入灭过菌的小烧杯中，倒入７５％乙醇使之刚好淹没外植体，并不断轻晃烧杯，以利于增强灭菌效果，１５～２０ｓ后快速倒掉乙醇，用无菌水重复冲洗４遍，再用０．１％的氯化汞对外植体消毒６～８ｍｉｎ，灭菌结束后倒出消毒液，倒入适量的无菌水重复冲洗３～４遍。把消毒后的金钗石斛幼茎放在无菌纸上或无菌容器里，用无菌刀片切割成含１～２个节的茎段，接种在相应的培养基上，每瓶接８个茎段。在２３～２７℃，光照１２ｈ／ｄ，光照度２０００ｌｘ的条件下培养。

 

　　１．２．３生根培养改良ＭＳ２基本培养基的制备：ＭＳ＋１００ｇ／Ｌ香蕉＋２．０ｇ／Ｌ活性炭＋２５ｇ／Ｌ蔗糖＋６．３ｇ／Ｌ琼脂，ｐＨ５．６～５．８。

 

　　以改良ＭＳ２为基础培养基，添加不同浓度的ＮＡＡ和ＩＢＡ。将启动培养获得的无菌丛生芽，在无菌条件下切成单芽，转接到生根培养基上，共设３个处理（表２），每个处理接种１０瓶，每瓶接种１０个芽，培养２８～３５ｄ。

 

　　１．２．４移栽组培瓶中的金钗石斛苗一直处于无菌、高湿和弱光照的环境中［９，１０］，因此，叶片缺乏角质层、蜡质层，加之细胞间隙大，气孔多而开张大，根部根毛不发达，有些根由愈伤组织发育而来，因此其输导组织与芽内的输导组织衔接不好，虽外观上肉质根粗壮，实际上其吸水能力较弱，既喜潮湿、又怕沤根。刚出瓶移栽的金钗石斛苗，生长条件在多个方面均有很大的改变，杂菌增加、湿度降低、光照增强、温度升高、温差变大［１１，１２］。在此环境中，植株易感染菌，叶片失水严重，根系吸水能力不足，吸水量小于蒸腾量，造成吸水与蒸腾失衡，最后导致萎蔫死亡。

 

　　要想解决这些问题，首先要为出瓶苗消毒，同时保证空气湿度、适当遮光并选择合适的栽培基质。当组培瓶中的苗高度达到６～８ｃｍ时，敞开瓶口放置３～４ｄ（时间过长培养基易发霉变质）［１３，１４］，让小苗叶片初步接触大环境以加速角质层的产生。然后挑选根系发育良好、粗壮的苗，洗净培养基，经代森锰锌消毒后，放置于阴凉处晾干，移栽到基质中，每个处理６０株苗，每６株丛植在１６ｃｍ×１４ｃｍ的营养钵中，合理地保湿、遮光。

 

　　２结果与分析

 

　　２．１启动培养中取材部位、基本培养基和激素配比的筛选结果

 

　　将消毒接种后的茎段启动培养５６ｄ，统计结果见表１。从表１可以看出，根据金钗石斛的诱芽率分析，启动培养的最佳部位是幼茎基部，最适基本培养基为改良ＭＳ１，６-ＢＡ：ＮＡＡ最理想的配比为６．０ｍｇ／Ｌ：０．２ｍｇ／Ｌ，此时诱芽率可达９３.00％（图１Ａ）。

 

　　２．２改良ＭＳ２与不同激素配比对金钗石斛生根的影响

 

　　金钗石斛生根培养时，改良ＭＳ２与不同激素配比对其生根的影响结果见表２。从表２可以看出，处理３培养基培养的金钗石斛无论是生根率、根数，还是根的生长性状都优于处理１、处理２。结果表明，金钗石斛生根培养基以改良ＭＳ２＋６．０ｍｇ／ＬＮＡＡ＋０．５ｍｇ／ＬＩＢＡ为最佳，生根率高达９５％（图１Ｂ）。

 

　　２．３不同基质对金钗石斛组培苗移栽成活率的影响

 

　　金钗石斛组培苗移栽３０ｄ后计算幼苗成活率，统计结果见表３。从表３可以看出，金钗石斛组培苗以处理４即水苔＋蛭石（３∶２）调配的基质移栽成活率最高，达到９０％（图１Ｃ）。

 

　　３结论与讨论

 

　　目前，金钗石斛组培快繁主要通过原球茎途径和丛生芽途径。原球茎途径是利用各种外植体诱导愈伤组织形成原球茎，进而诱导分化产生幼苗。丛生芽途径是利用外植体不经愈伤组织直接诱导丛生芽，是一条“芽繁芽”的途径，具有技术难度低、保证遗传稳定性、诱导时间短、诱导率较高等优点。本试验利用丛生芽途径进行金钗石斛组培快繁，结果表明，金钗石斛启动培养的最佳部位是幼茎基部，最适培养基为MS+6.0ｍｇ／Ｌ6-BA+0.2ｍｇ／ＬNAA+100ｍL／Ｌ椰乳+25ｇ／Ｌ蔗糖+6.3ｇ／Ｌ琼脂，诱芽率可达93.00%；最适生根培养基为ＭＳ＋６．０ｍｇ／ＬＮＡＡ＋０．５ｍｇ／ＬＩＢＡ＋１００ｇ／Ｌ香蕉＋２．０ｇ／Ｌ活性炭＋２５ｇ／Ｌ蔗糖＋６．３ｇ／Ｌ琼脂，生根率高达９５％。通过试验发现，活性碳对金钗石斛生根有显著的作用，主要因为活性碳给植物造成了生根的暗环境，同时可以吸附植物代谢产生的一些生长抑制剂。活性碳对生根的显著作用在其他植物的组织培养中也有报道［１５］。同时试验发现，香蕉对金钗石斛丛生芽的生根有较好的促进作用，有利于培育壮苗，这与在蝴蝶兰丛生芽的组织培养研究中的试验结果一致［１６］。金钗石斛最优的组培苗栽培基质是水苔＋蛭石（３∶２），移栽成活率高达９０％。因为水苔吸水性和保水性强，蛭石透气性强，二者搭配效果良好。而处理３即珍珠岩＋蛭石（２∶１）混合的基质成活率最低，只有３０％，可能是金钗石斛的根系生长需要偏酸性的环境，珍珠岩占的比例大又偏碱性，导致基质酸度不够。

 

　　在今后的工作中还需要进一步研究金钗石斛在中原地区野外大面积栽植的途径，以及野生金钗石斛与人工栽培的金钗石斛在生物碱成分、含量及其药用价值等方面的差异。

 

　　参考文献：

 

　　［１］李振坚，于耀，王雁，等．四种石斛兰种胚发育进程研究［Ｊ］．广西植物，２０１０，３０（３）：３３４－３３８．

 

　　［２］刘莉，李智敏，李晚谊．金钗石斛的研究进展［Ｊ］．云南大学学报（自然科学版），２００９，３１（Ｓ１）：５０９－５１２．

 

　　［３］吴辉，赵俊，宋锡全．四种不同培养基对诱导金钗石斛幼苗生根的影响［Ｊ］．贵州科学，２００７，２５（２）：６５－６７．

 

　　［４］宋锡全，宋琴曲．金钗石斛茎段培养再生绿色植株［Ｊ］．贵州师范大学学报（自然科学版），２００３，２１（３）：８０－８２．

 

　　［５］唐金刚，卢文芸，乙引，等．药用金钗石斛快速繁殖的研究［Ｊ］．贵州科学，２００７，２５（１）：５９－６２．

 

　　［６］孙廷，杨玉珍，胡如善．金钗石斛的组织培养和快繁技术［Ｊ］．山东农业大学学报（自然科学版），２００５，３６（１）：４７－５０．

 

　　［７］李庆宏，宋常美．金钗石斛愈伤组织培养［Ｊ］．贵阳学院学报（自然科学版），２０１１，６（３）：７６－７９.

 

　　［８］张艳，范俊安，李泉森，等．金钗石斛培养初步研究［Ｊ］．时珍国医国药，２００１，１２（２）：１８９－１９０．

 

　　［９］郑永娟，汤春梅．植物组织培养［Ｍ］．北京：中国水利水电出版社，２０１２．

 

　　［１０］陈世昌．植物组织培养［Ｍ］．北京：高等教育出版社，２０１１．

 

　　［１１］葛胜娟．植物组织培养［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２００８．

 

　　［１２］彭星元．植物组织培养技术［Ｍ］．北京：高等教育出版社，２００６．

 

　　［１３］张凤银，张萍，张静，等．金钗石斛兰组培苗的生根培养和移栽［Ｊ］．江汉大学学报（自然科学版），２００９，３７（２）：９８－１００．

 

　　［１４］唐德英，王云强，段立胜．金钗石斛种苗繁育技术［Ｊ］．时珍国医国药，２００７，１８（４）：１０２０．

 

　　［１５］徐莉莉，聂世现，黄文静，等．冬凌草组织培养及其愈伤组织诱导研究［Ｊ］．生物学杂志，２０１０，２７（３）：２４－２６．

 

　　［１６］李金丽，洪丽萍．蝴蝶兰丛生芽途径的组织培养技术［Ｊ］．热带作物学报，２０１０，３１（４），６１０－６１３．