论文投稿_医学论文投稿_核心期刊,职称论文投稿发表_论文部落

　　1.5.4 病原真菌的种属分类 根据遗传进化分析结果、真菌形态结构，并结合文献报道，对真菌进行种属划分。
　　2 结果
　　2.1 病料的镜检
　　镜检发现15 份皮屑病料样本中有6 份含有大量折光性较强的卵圆形分生孢子及丝状真菌，镜检阳性率为40% ；未见疥螨等寄生虫及虫卵，初步判断该皮肤病由真菌感染引起，排除寄生虫感染。
　　2.2 真菌分离
　　从皮屑病料中共分离到23 株真菌（表1），根据真菌分生孢子及分生孢子梗的形态初步分属为：链格孢属（Alternaria）2 株、镰刀菌属（Fusarium）4 株、曲霉属（Aspergillus）7 株、横梗霉属（Lichtheimia）2 结果
　　2.1 病料的镜检
　　镜检发现15 份皮屑病料样本中有6 份含有大量折光性较强的卵圆形分生孢子及丝状真菌，镜检阳性率为40% ；未见疥螨等寄生虫及虫卵，初步判断该皮肤病由真菌感染引起，排除寄生虫感染。
　　2.2 真菌分离
　　从皮屑病料中共分离到23 株真菌（表1），根据真菌分生孢子及分生孢子梗的形态初步分属为：链格孢属（Alternaria）2 株、镰刀菌属（Fusarium）4 株、曲霉属（Aspergillus）7 株、横梗霉属（Lichtheimia）2 株、毛癣菌属（Trichophyton）2 株、附球菌属（Epicoccum）4 株、毛霉菌属（Mucor）2 株。其中，15 份病料样本中有10 份可以分离到毛癣菌属真菌，培养分离率达67% ，且该属真菌在STIY 培养基、37℃ 条件下生长较快；其次横梗霉属、曲霉属真菌分离率分别达40%、47%。
　　2.3 皮肤病原真菌的筛选及病原回收
　　小鼠皮肤感染试验表明，毛癣菌属真菌对小鼠皮肤侵染最为严重（图2）。侵染24 h 后，6 只小鼠头面部、颈部、后肢出现不同程度的瘙痒症状，严重的出现撕咬、皮肤破损；感染10 d 后，6 只小鼠感染部位均出现白色皮屑增多，形成结痂并逐渐增厚，脱毛以致毛发不生长等与发病牛相似的临床症状，整个病程可达35 d 。发病小鼠皮屑、毛发经10% KOH 溶液镜检发现有大量菌丝及椭圆形小分生孢子存在，被感染小鼠的毛发横纹结构消失，发根毛发内产生大量孢子。小鼠皮屑经培养可分离到与侵染真菌显微形态结构相似的菌落，培养阳性率达100% 。横梗霉属、曲霉属真菌对6 只小鼠皮肤亦能产生不同程度的感染，但症状较轻，小鼠发病部位形成坚硬结痂，但15 d 后皮屑逐渐脱落、毛发生长迟缓，小鼠皮屑镜检可见丝状真菌，毛发外具大量孢子，经分离培养可分离、回收到侵染真菌。其它属真菌感染及对照组小鼠未见明显炎症反应，且10 d 后小鼠毛发即生长完全。小鼠皮肤感染试验结果表明，病原真菌主要为毛癣菌属真菌，横梗霉属、曲霉属真菌引起继发感染。2.4 病原真菌的形态特征经培养（图3），毛癣菌属真菌NXGY1、NXGY2
　　形态结构相似，菌落生长缓慢，在STIY 培养基、37 ℃条件下生长较快。培养1 w 可形成白色绒毛菌落，质地坚硬，显微观察菌丝呈丝状，2—6 μm 的梨形、棒形小分生孢子沿菌丝侧生长形成鹿角状菌丝；培养2w 菌落形成白色粉末状菌落，无色素产生，具典型的链状厚垣孢子，显微观察可见横径为3—4 μm 的有隔弯曲菌丝，鼠尾形大分生孢子少见，一般长30—100μm；DTM 培养基培养8 d 可使培养基变红，根据文献报道[12-14]将NXGY1、NXGY2 初步鉴定为疣状毛癣菌（T. verrucosum）。
　　2.5 病原真菌同源性比较及遗传进化分析
　　经琼脂糖凝胶电泳分析，病原真菌NXGY1、
　　NXGY2 的基因组DNA 全序列大小超过5000 bp，ITS序列片段长度约680 bp（图4）。经测序，病原真菌NXGY1、NXGY2 的ITS 序列大小分别为660、662 bp，获得的NCBI GenBank 登录号分别为：KJ816333、KJ816334；ITS 序列同源性比较结果显示，NXGY1、NXGY2 与疣状毛癣菌（T. verrucosum 登录号：
　　AB443930、Z98003、AB491473、AB058851）同源性高达99%—100%；构建的系统发育树表明（图5），NXGY1、NXGY2 与毛癣菌属疣状毛癣菌在同一分支上，自检支持率达86%，表明NXGY1、NXGY2 与疣状毛癣菌遗传距离最近。
　　2.6 病原真菌的种属分类
　　病原真菌NXGY1、NXGY2 具有典型的链状厚垣孢子、鹿角状菌丝，小分生孢子呈梨形或棒形，菌丝分隔、弯曲等显微结构，与毛癣菌属真菌较为相似[15]；其ITS核苷酸序列与疣状毛癣菌的同源性最高、遗传距离最近。
　　因此，根据真菌形态结构、遗传进化分析结果，结合相关文献报道，本研究最终将NXGY1、NXGY2 病原真菌鉴定为疣状毛癣菌。
　　3 讨论
　　牛真菌性皮肤病常造成犊牛大规模感染发病 [16]，通常又称“皮癣”或“钱癣”。 据报道，牛的皮肤病原真菌主要为毛癣菌属疣状毛癣菌，该菌还可引起羊、马、骆驼、驴感染[17] 。此外， 须癣毛癣菌（ T.
　　mentagrophytes）、犬小孢子菌（M. canis）、石膏样小孢子菌（M. gypseum）也可引起牛皮肤感染[18-19]。
　　本研究通过病料镜检及分离、纯化培养，经真菌形态学特征[20-21]对病原真菌作出初步分类鉴定。真菌的ITS 序列具有高度的保守性，常作为真菌近似种及亚种的鉴别依据[22-24]，通过与GenBank 数据库进行真菌ITS 序列同源性比较并进行系统发育分析，鉴定本研究分离的菌株为毛癣菌属疣状毛癣菌。小鼠皮肤感染试验结果表明，所鉴定的毛癣菌具有致病性。本研究还分离到横梗霉属（Lichtheimia）、曲霉属（Aspergillus）等腐生性真菌，鉴定为L. ramosa、烟曲霉（A.
　　fumigatus）及杂色曲霉（A. versicolor），这些腐生性真菌可引起继发感染，具有一定的致病性[25-27]。近年来由于集约化养殖技术的发展，糖皮质类激素及抗生素在畜牧养殖业广泛应用，常导致动物机体免疫力大幅度下降，一些腐生性真菌病发病率逐年上升[28]，值得关注。
　　牛真菌性皮肤病的发生及流行主观归因于养殖人员以及科研人员的重视程度较低，客观归因于厂区养殖条件较差。研究发现，由于在临床诊治过程中牛真菌性皮肤病易与疥螨等寄生虫病混淆，常导致临床给药错误，治疗效果较差。目前，对牛真菌性皮肤病的研究主要集中在临床诊断及治疗上，对病原真菌种属分类、快速鉴别诊断研究较少，其致病机理不清楚。
　　因而，针对牛真菌性皮肤病的病原鉴别、致病机理、治疗药物筛选及剂型等方面有待进一步深入研究。
　　4 结论
　　本研究从15 份肉牛皮屑病料样本中共分离到23株真菌，分属于毛癣菌属（Trichophyton）、曲霉属（Aspergillus）、横梗霉属（Lichtheimia）、链格孢属（Alternaria）、镰刀菌属（Fusarium）、附球菌属（Epicoccum）、毛霉菌属（Mucor）。经筛选，其中2 株毛癣菌属真菌为牛真菌性皮肤病的主要致病菌，通过真菌形态学特征及遗传进化分析结果将病原真菌NXGY1、NXGY2 鉴定为疣状毛癣菌。