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组织块贴壁法培养SD大鼠腹主动脉平滑肌细胞及鉴定(2)
时间：2015-04-01 11:05 文章来源：http://www.lunwenbuluo.com 作者：谭元生等 点击次数：
1.4平滑肌细胞鉴定
1.4.1 细胞形态学观察 用倒置相差显微镜观察细胞大小、形态、生长特点及排列方式等。
1.4.2 细胞存活率的检测 消化传代的细胞悬液9滴，加入1滴0.4 %台盼蓝液，混匀后3 min内吸取1滴于血球计数器上，置显微镜下观察，凡着色细胞均为不正常细胞或死亡细胞。共计数1 046个细胞。
1.4.3 细胞免疫组化 第5代对数生长期的细胞悬液接种到（先放置2张7 mm×22 mm盖玻片）培养瓶中，培养2 d～3 d取出盖玻片，PBS漂洗5 min×3次，4%的多聚甲醛室温下固定（20～30）min，PBS再次漂洗5 min，3次，然后按照即用型SABC免疫组化染色试剂盒和DAB显色试剂盒说明书逐条进行操作。
2 结 果
2.1 平滑肌细胞培养及形态学观察 原代培养6 d～7 d，倒置显微镜下可观察到少量细胞自组织块边缘游出，形态呈梭形或长梭形，但不是所有的组织块周边都有，渐向外生长形成细胞晕，进而形成细胞簇，大小略有差异。传代后80%～90%的细胞可重新贴壁生长，继续培养，数量逐渐增加，4 d～6 d后长成致密细胞层，出现“峰谷”状结构细胞恢复为梭形或长梭形外观，细胞大小趋于一致。
2.2 细胞存活率 台盼蓝液染色共计数1 046个细胞，其中30个阳性，约有95%以上的细胞染色呈阴性，表明培养的细胞消化传代后成活率较高。
2.3 细胞组织学鉴定 培养第5代的细胞经特异的SMαactin免疫细胞化学染色后，胞浆着棕黄色，呈阳性表达。结果表明，所得细胞为典型的平滑肌细胞。
3 讨 论
血管平滑肌细胞是构成血管壁组织结构及维持血管张力的主要细胞成分，其结构和功能的改变是导致高血压、动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等多种心血管病的细胞病理学基础[3]。目前常用的血管平滑肌细胞培养方法有酶消化法[4]和组织贴块法。其中，酶消化法由于所需组织量较大、实验操作复杂、消化酶价格昂贵、酶作用时间不易掌握、消化酶本身对细胞有毒性作用等原因，常常不是细胞培养的首选方法。而组织贴块法具有操作简单易行、存活率较高、纯度较高、实验重复性高等优点，成为许多研究者获取原代平滑肌细胞的重要途径。本研究采用了组织块培养法，经形态学观察及免疫组化方法鉴定和台盼蓝液染色检查细胞成活率高，形态学和功能良好。
本实验体会有：①每次实验前要仔细检查准备工作，制定具体实验步骤，先把本次实验所需的PBS、DMEM培养液、实验药品配制，分装好并移入超净工作台，检查酒精灯、酒精棉球等消毒用品，紫外下消毒30 min。②严格无菌操作过程。包括实验环境与操作台面消毒、试剂消毒，以及洗手、关门、换鞋换衣等细节，处死动物后用75 %酒精浸泡6 min，取动脉宜在细胞培养室超净工作台内进行。③在贴壁法培养血管平滑肌细胞过程中，仍然存在一些需要注意的问题：取材时严格无菌操作，动作轻柔，避免大力牵拉血管造成损伤，不利于后期细胞的生长。④组织块不应剪切过小，1 mm×1 mm大小适中，组织边缘要求整齐、光滑，这样利于细胞从组织块中游离出和生长。组织块间距应为5 mm，以保证细胞从组织块游出后有足够的生长空间并保持局部细胞密度的均匀，从而获得尽量多的原代细胞。
因此，在今后的类似实验中研究者应不断在实践中摸索、改进，为获取纯度、存活率高的平滑肌细胞提供扎实的基础。
本实验严格按照实验流程，整个过程严格无菌操作，最终通过实验鉴定，获得了较为理想的大鼠腹主动脉平滑肌细胞，为接下来即将进行中药含药血清干预平滑肌细胞增殖的实验提供了存活率、纯度都较高的实验材料。
参考文献：
[1]杨传华，陆峰，张翠英.高血压血管重塑与络病的相关性[J].山东中医杂志，2005，24（11）：643645.
[2]Gohlke P，Lamberty V，KuwerL，et al.Vascularre modeling insystemic hypertension [J].Am J Cardiol，1993，71：2E7E.
[3]戴恩来，薛国忠，武俊斌，等.大鼠血管平滑肌细胞的贴块法培养[J].中国儿科杂志，2007，3（2）：4748.
[4]王明勇，陈枫，陈庄.酶消化法分离老龄SD大鼠血管平滑肌细胞[J].重庆医学，2011，12（40）：34823483.
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