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　　1.4  测定方法

　　可溶性蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法;游离氨基酸含量测定参照GB/T5009.124—2003 的方法;呈味核苷酸测定参照SB/T 10484—2008的方法;粗多糖含量测定参照NY/T 1676—2008的方法。

　　2  结果与分析

　　2.1  酶A酶解工艺优化

　　2.1.1  料液比对可溶性蛋白质溶出率的影响  取一定量香菇柄粗粉，分别按料液比1∶3、1∶6、1∶12、1∶24加水，加入酶A，用量（以底物的质量计算，下同）0.20%，在pH为4.5的条件下恒温55 ℃水解2 h。由图1可知，可溶性蛋白质溶出率随着料液比的倍数增加而升高，当料液比高于1∶6时，可溶性蛋白质溶出率增长趋缓，继续提高料液比，可溶性蛋白质的溶出率仍有升高，但提高的量不明显;若料液比过低则提取不彻底，而料液比过高，则降低了提取液的固形物含量，浓缩成本较大，不利于以后的分离。因此，确定料液比为1∶6。 

　　2.1.2  pH对可溶性蛋白质溶出率的影响  取一定量香菇柄粗粉，按料液比1∶6加水，酶A用量0.20%，在不同pH （3.5、4.5、5.5、6.5）条件下恒温55 ℃水解2 h，结果见图2。由图2可知，可溶性蛋白质溶出率随着pH的升高先增加后降低，pH 在4.5时可溶性蛋白质的溶出率最高，可能的原因是每种酶都有一个最适pH，当在此条件下反应时，酶的活性最高，反应条件与其偏离的越远，酶的活性越低，从pH作用的范围来看，酶A这种纤维素酶最适pH为4.5。

　　2.1.3  酶A添加量对可溶性蛋白质溶出率的影响

　　取一定量香菇柄粗粉，按料液比1∶6加水，选择不同酶A添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%），在pH为4.5条件下保温55 ℃水解2 h，结果见图3。从图3可以看出，可溶性蛋白质溶出率随着加酶量的增加而升高，当酶添加量达到0.2%后，再增加酶用量，可溶性蛋白质溶出率增加缓慢，这可能是由于在低酶浓度的情况下，底物能够完全与酶结合，从而破坏细胞壁，使其内容物释放，但在较高酶浓度情况下，底物不能对酶达到饱和，从而使一部分酶分子无法发挥效用。此外，从经济效益出发，酶添加量不宜过高，因此取0.20%为宜。

　　2.1.4  酶解温度对可溶性蛋白质溶出率的影响  取一定量香菇柄粗粉，按料液比1∶6加水，酶A添加量0.20%，pH 4.5条件下，选择在不同温度（40、45、50、55、60 ℃）水解2 h，结果见图4。每种酶都有一个最适温度，当在此条件下反应时，酶的活性最高，反应条件与其偏离的越远，酶的活性越低。由图4可知，在较低温度范围内，随着温度的上升酶活性也随之提高，可溶性蛋白质的溶出增多，在55 ℃左右达到最高，随着温度继续上升将使酶的稳定性下降，部分酶蛋白分子开始失活。因此，选择酶解温度为55 ℃适宜。

　　2.1.5  酶解时间对可溶性蛋白质溶出率的影响  取一定量菇柄粗粉，按料液比1∶6加水，酶A用量0.20%，pH 4.5，温度55 ℃，选择在不同时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）内进行酶解，结果见图5。由图5可知，随着酶解时间的延长，可溶性蛋白质溶出率逐渐增加，当酶解时间超过2.0 h后，可溶性蛋白质溶出率增加趋缓，可能是在较短的反应时间内，酶分子快速破坏细胞壁，使细胞内容物释放，随着时间的延长，细胞壁已经被完全破坏，内容物已充分溶解，使得可溶性蛋白质溶出率升高趋势变缓，因此，酶解时间确定为2.0 h。

　　由以上分析可知，食用菌水解酶酶A的酶解工艺条件为料液比1∶6，酶A添加量0.20%，最适pH 4.5，温度55 ℃，酶解2.0 h，在此条件下可溶性蛋白溶出率为4.12%。

　　2.2  酶B酶解条件

　　2.2.1  pH对氨基酸释放率的影响  取酶A酶解处理后的样品，选取不同pH （3.5、4.5、5.5、6.5、7.5），酶B添加量0.1%，温度50 ℃，酶解4 h，结果见图6。氨基酸的释放率随着pH的升高而增加，至6.5左右达到最高，随后出现下降，由反应结果可知，该酶的pH作用范围为6～7，因此选择pH为6.5。

　　2.2.2  酶B添加量对氨基酸释放率的影响  取酶A酶解处理后的样品，选取不同的酶B添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%），pH 6.5，温度50 ℃，酶解4 h，结果见图7。由图7可知，随着酶添加量的增加，氨基酸释放率上升，达到0.15%后，继续提高添加量氨基酸释放率上升平缓。综合考虑成本等因素，选择酶B添加量为0.15%。

　　2.2.3  酶解温度对氨基酸释放率的影响  取酶A酶解处理后的样品，选取在不同温度（30、40、50、60 ℃）下，酶B添加量为0.1%，pH 6.5，酶解4 h，结果见图8。由图8 可以看出，温度对氨基酸释放率影响较大。随着温度的升高，氨基酸释放率先增加后降低，温度低于30 ℃或高于60 ℃均不利于水解，最适温度为50 ℃。

　　2.2.4  酶解时间对氨基酸释放率的影响  取酶A酶解处理后的样品，选取不同处理时间（2、4、6、8 h），酶B添加量为0.1%，温度50 ℃，pH 6.5，结果见图9。由图 9 可知，随着酶解时间的延长，氨基酸的释放率也随之增加，当酶解时间超过6 h 后，氨基酸释放率的增幅趋于平缓，农业科学可能是在较短反应时间内，酶分子快速破坏蛋白质分子，使其快速转化为氨基酸，随着时间的延长，蛋白质分子大部分被水解成了多肽和氨基酸，使得氨基酸释放率升高趋势变缓，考虑到实际生产情况，挥发性物质因水解时间过长损失较大， 对产品的滋味和气味不利，酶解作用6 h 较为适宜。

　　由以上分析可知，香菇菇柄经过酶A处理后，酶B进行酶解的最适工艺条件为pH 6.5，酶B添加量 0.15%，温度50 ℃，酶解6 h。此条件下，总氨基酸释放率为2.16%。

　　2.3  不同工艺的比较试验

　　对热水浸提法、纤维素酶酶解法、复合酶法3种方法释放香菇柄中呈味物质的效果进行了比较，结果见图10。由图10可知，游离氨基酸、呈味核苷酸和多糖的释放效果由高到低依次为复合酶法、纤维素酶单酶法和热水浸提法。复合酶法的氨基酸释放率较热水浸提法有大幅提高，复合酶的使用比单独加入纤维素酶效果更好，因为有蛋白酶参与作用，使胞内溶出的蛋白质加快分解，酶解液中氨基态氮含量得以显著提高，酶解液风味得到很大改善。复合酶法同时也大幅提高了多糖的溶出率，可能与纤维素酶的破壁作用有关。