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摘要：为观察老鹳草（ＧｅｒａｎｉｕｍｗｉｌｆｏｒｄｉｉＭａｘｉｍ）膏对佐剂性关节炎（ＡＡ）大鼠模型血清细胞因子ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－β１含量的影响，探讨老鹳草对类风湿性关节炎的作用机理，试验将ＳＤ大鼠尾根部皮内注射完全弗氏佐剂（ＣＦＡ）造模，将造模成功的ＡＡ大鼠随机分为３组，于第１０天开始分别以生理盐水（模型对照组）、老鹳草膏（老鹳草膏组）和ＭＴＸ（ＭＴＸ组）处理各试验组，同时设置空白对照组。第４５天乙醚麻醉后眼底采血、ＥＬＩＳＡ法检测血清中ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－β１的浓度。结果表明，与模型对照组和ＭＴＸ组相比，老鹳草膏可显著降低ＡＡ大鼠血清异常升高的ＶＥＧＦ水平，提高血清ＴＧＦ－β１含量。表明老鹳草可改善大鼠足关节状态，具有免疫调节功能，有助于机体恢复免疫稳定状态。

 

　　关键词：佐剂性关节炎；老鹳草（ＧｅｒａｎｉｕｍｗｉｌｆｏｒｄｉｉＭａｘｉｍ）膏；细胞因子；甲氨蝶呤

 

　　类风湿性关节炎（Ｒｈｅｕｍａｔｉｏｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＲＡ）为一种慢性自身免疫性疾病，因能引起关节功能障碍而严重影响人类健康，目前已建立多种ＲＡ动物模型进行科研试验，其中应用广泛且较成熟的动物模型是胶原诱导性关节炎（Cｏｌｌａｇｅｎｉｎｄｕｃｅｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＣＩＡ）和佐剂性关节炎（Aｄｊｕｖａｎｔａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＡＡ）。有文献报道两种模型在临床表现、实验室指标和病理机制上都与人临床ＲＡ相似或相近，是研究ＲＡ、筛选抗炎免疫药物较理想的动物模型［１，２］。

 

　　本试验利用完全弗氏佐剂构建了ＡＡ大鼠模型，并通过关节肿胀度及血清细胞因子ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－β１的变化对比观察分析了老鹳草（ＧｅｒａｎｉｕｍｗｉｌｆｏｒｄｉｉＭａｘｉｍ）膏和甲氨喋呤（ＭＴＸ）干预下模型大鼠上述指标的变化。

 

　　１材料与方法

 

　　１．１试验动物

 

　　ＳＤ大鼠６０只，雌３６只，雄２４只，体重（２５０±２３）ｇ，购自济南实验动物饲养所，适应性喂养一周后进行试验。

 

　　１．２药物与试剂

 

　　ＶＥＧＦ试剂盒、ＴＧＦ－β１试剂盒，均为美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司生产；完全弗氏佐剂，美国ｓｉｇｍａ公司生产；ＭＴＸ，购于潍坊市人民医院，使用前用生理盐水（ＮＳ）配制为０．０２５ｍｇ／ｍＬ悬浊液。

 

　　老鹳草，６月下旬采自潍坊安丘，除去根部及杂质，洗净晾干切段备用。

 

　　１．３方法

 

　　１．３．１老鹳草膏的制作老鹳草磨碎后６０目标准筛分样，以黄原胶和蜂蜜作为增稠剂，反复搅拌为膏状，４℃冰箱保存备用。

 

　　１．３．２动物模型的制作与分组ＳＤ大鼠６０只随机取１０只作为空白对照，其余５０只为模型组，制作佐剂性关节炎模型，方法是完全弗氏佐剂（ＣＦＡ）充分振荡摇匀后，取０．１ｍＬ于大鼠尾根部皮内注射，每天观测关节肿胀度，第１０天测量后取符合模型条件的４２只随机分为３组，每组１４只，分别为模型对照组、老鹳草膏组和ＭＴＸ组，分别以生理盐水、老鹳草膏和ＭＴＸ处理各组。具体处理方法是：老鹳草膏组大鼠后肢关节处涂抹老鹳草膏，每天早晚各１次；ＭＴＸ组按０．０２５ｍｇ（１ｍＬ）／只灌胃，每周１次；模型对照组ＮＳ灌胃（１ｍＬ／只）；空白对照组尾根部皮内注射０．１ｍＬＮＳ。每周１次，连续给药５周（３５ｄ）。

 

　　１．３．３关节肿胀度的观测用螺旋千分尺测量大鼠双后肢足垫厚度并计算关节肿胀度。各试验组分别于注射药物前（０ｄ）及注射后１、３、５、7、１０、１６、３０、４５ｄ测量。关节肿胀度计算公式如下：

 

　　关节肿胀度＝

 

　　■×１００％

 

　　１．３．４老鹳草膏对ＡＡ大鼠血清中细胞因子的影响第４５天测量后乙醚麻醉大鼠并眼底采血，２ｍＬ／只，用ＥＬＩＳＡ法（按照ＥＬＩＳＡ试剂盒说明书操作）检测血清中细胞因子ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－β１的浓度。

 

　　１．３．５统计学处理试验数据均以ｘ±ｓ表示；结果用ＳＰＳＳ１３１０统计软件进行分析。关节肿胀度采用多个独立样本非参数检验方法进行统计；细胞因子浓度采用单向方差分析法进行统计，两组间比较采用ｔ检验。

 

　　２结果

 

　　２．１ＡＡ大鼠模型关节肿胀度观测结果

 

　　大鼠致炎后３～４ｈ出现症状，１５ｈ足肿胀达高峰，表现为早期的炎症反应，持续２～３ｄ逐渐减轻，７～８ｄ后再度肿胀，且进行性加重。大鼠行动不便，体重下降，易激惹，其表现类似人类ＲＡ，因大鼠后足肿胀程度远高于前足，测量时以后足为基准。

 

　　由表１可见，造模第１０天大鼠后足平均厚度与空白对照组相比差异极显著（Ｐ＜０．０１），空白对照组大鼠未见明显反应。４２只大鼠符合模型制备标准，制模成功率８４％。

 

　　２．２老鹳草膏干预后大鼠后足肿胀度变化

 

　　造模第１０天开始给予老鹳草膏及ＭＴＸ药物干预，并分别于第１６、３０、４５天测量各组大鼠右后足关节厚度，其结果见表２。由表２可见，第１６天时模型对照组、老鹳草膏组、ＭＴＸ组之间大鼠右后足厚度差异不显著（Ｐ＞０．０５），但均极显著（Ｐ＜０．０１）高于空白对照组；第３０天时老鹳草膏组、ＭＴＸ组大鼠右后足厚度均显著（Ｐ＜０．０５）低于模型对照组，ＭＴＸ组效果好于老鹳草膏组（Ｐ＜０．０５）；第４５天时老鹳草膏组和ＭＴＸ组右后足厚度极显著（Ｐ＜０．０１）低于模型对照组，老鹳草膏组和ＭＴＸ组相比差异不显著（Ｐ＞０．０５）。表明老鹳草膏与ＭＴＸ皆可降低ＡＡ大鼠足关节肿胀程度，缓解运动障碍。

 

　　２．３血清细胞因子检测结果

 

　　由表３可见，模型对照组血清中ＶＥＧＦ的含量较正常对照组升高，而ＴＧＦ－β１的含量则较正常对照组下降。连续给药３５ｄ后，老鹳草膏组ＴＧＦ－β１的水平与模型对照组相比有明显升高（Ｐ＜０．０１），ＶＥＧＦ的水平与模型对照组相比明显降低（Ｐ＜０．０１）。

 

　　３讨论

 

　　ＲＡ是以多关节炎为主要临床表现、以炎性的滑膜炎为特征的慢性系统性疾病，新生血管的形成、炎症细胞的浸润和滑膜细胞的增生是滑膜早期改变的标志。ＲＡ的病理机制目前还不清楚，许多研究已经表明淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、滑膜细胞等多种炎症细胞介导的异常细胞免疫及体液免疫，导致关节局部和全身的免疫功能紊乱，在ＲＡ的病理中起着重要作用［３］。人们已证实细胞因子ＶＥＧＦ参与了滑膜组织炎症的形成和发展［４］，ＴＧＦ－β１可调节细胞的生长和分化，在ＲＡ活动期血清水平下降，而炎症初期可出现应激性升高抑制炎性反应的发展［３］。因此在老鹳草膏对大鼠佐剂性关节炎的干预试验中测定了这些数值的变化。

 

　　试验测定表明老鹳草全草含老鹳草鞣质（Gｅｒａｎｉｉｎ）及金丝桃苷（Hｙｐｅｒｉｎ）等成分，其主要作用是抗菌止泻、祛风活血等［５，６］，在潍坊地区当地人们经常将其鲜草捣碎敷于关节表面或全草浸酒治疗关节炎症且有一定效果。本试验采用老鹳草膏外用，观察对ＡＡ大鼠关节肿胀度及血清细胞因子ＶＥＧＦ和ＴＧＦ－β１的影响，试验结果表明，经过老鹳草膏连续给药３５ｄ后，ＡＡ大鼠足关节肿胀度得到明显改善（Ｐ＜０．０１），血清学检测也显示ＴＧＦ－β１的水平与ＡＡ模型对照组比较有明显升高（Ｐ＜０．０１），ＶＥＧＦ的水平与ＡＡ模型对照组相比明显降低（Ｐ＜０．０１），这与ＭＴＸ灌胃相比从检测指标看疗效略低。需要注意的是，本次试验采用单味老鹳草膏外用，但制作老鹳草膏时因加入了蜂蜜等增稠成分，以及老鹳草对皮肤有一定刺激作用，大鼠经常舔食涂抹的膏剂，必然有部分老鹳草膏会通过消化道进入体内，因此在用药后期，多数大鼠出现不同程度的腹泻症状（这也表明虽然老鹳草膏有止泻作用，但长时间或较大剂量使用时能促进大肠的蠕动而出现泻下），导致大鼠食欲降低、体重减轻，有３只大鼠因腹泻死亡，由此提示长期使用老鹳草治疗类风湿性关节炎时，要注意控制经消化道摄入的量，外用时最好组方以提高疗效。同时ＭＴＸ组在试验后期也有２只因腹泻致死。

 

　　４结论

 

　　本试验结果表明，经过老鹳草膏连续给药３５ｄ后，大鼠足肿胀度得到明显改善。血清学检测也显示ＶＥＧＦ和ＴＧＦ－β１的水平有明显改善。老鹳草能降低ＡＡ大鼠足关节肿胀度，缓解症状，老鹳草也能调节血清中细胞因子的水平，可在免疫水平进行保护性调节，提示对人ＲＡ的治疗有一定作用。

 

　　参考文献：

 

　　［１］刘元刚，刘树滔，饶平凡．类风湿性关节炎啮齿动物模型的研究进展［Ｊ］．中国实验动物学报，２００７，１５（６）：４７０－４７３．

 

　　［２］陆声，梁崇礼，林月秋．类风湿性关节炎动物模型应用研究进展［Ｊ］．中国实验动物学杂志，２００１，１１（２）：１１２－１１４．

 

　　［３］张荒生，陈丽川，王进军，等．痹痛定分散片对大鼠ＡＡ模型血清ＴＧＦ－β１及滑膜组织病理形态学的影响［Ｊ］．光明中医，２００９，２４（４）：６４８－６５１．

 

　　［４］梁清华，何金华，李霞玲，等．痹肿消汤对实验性关节炎大鼠滑膜ＶＥＧＦ表达水平的影响［Ｊ］．湖南医科大学学报，２００２，２７（６）：４９１－４９４．

 

　　［５］雷海民，李强，柏冬，等．粗根老鹳草化学成分的研究［Ｊ］．中国中药杂志，２００７（４）：３４８－３４９．

 

　　［６］邢涛．老鹳草中黄酮类成分的药理、生物学作用［Ｊ］．吉林畜牧兽医，２００９（５）：１１－１３．