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　　[摘要]目的观察Plk-1基因过表达对gemcitabine诱导胰腺癌细胞AsPC-1化疗敏感性的影响。方法①将携带有人外源性Plk-1基因的真核表达质粒转染AsPC-1细胞系设为处理组，转染空载体设为对照组，无处理组设为空白组，转染24h后，提取细胞总RNA和总蛋白，利用RT-PCR法及Westernblot鉴定AsPC-1细胞内Plk-1基因和蛋白表达水平。②采用流式细胞术检测转染组细胞凋亡的改变。③不同浓度gemcitabine作用于转染细胞，MTT法测定转染48h后细胞增殖能力。结果①测序结果表明成功的从AsPC-1细胞总RNA中扩增Plk-1基因。RT-PCR结果表明：未转染组AsPC-1细胞组、转染空载体pcDNA3.1组及pcDNA3.1/Plk-1组24h各组细胞内Plk-1mRNA相对量分别为（2.14±0.16）、（2.18±0.15）、（2.58±0.18），转染pcDNA3.1/Plk-1组与其他各组相比，差异有高度统计学意义（P<0.01）。Westernblot结果显示：未转染组AsPC-1细胞组、转染空载体pcDNA3.1及pcDNA3.1/Plk-1组24h各组细胞内Plk-1基因的蛋白表达水平为（0.989±0.018）、（1.022±0.021）、（1.243±0.143），转染pcDNA3.1/Plk-1组与其他各组相比，差异有高度统计学意义（P<0.01）。②在gemcitabine作用下，pcDNA3.1/Plk-1转染组细胞凋亡率明显低于未转染组及空载体转染组，差异有高度统计学意义（P<0.01）。③AsPC-1/Plk-1转染组细胞的生长抑制率亦明显高于未转染组及空载体转染组，差异有高度统计学意义（P<0.01）。结论胞浆过表达Plk-1活性分子可明显降低gemcitabine诱导的AsPC-1细胞凋亡，增强其对化疗药物的耐受性。
　　[关键词]Plk-1基因；耐药性；Gemcitabine；胰腺癌
　　[中图分类号]R735.9[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2013）12（c）-0004-05Plk-1是一种存在于哺乳动物细胞中的丝/苏氨酸蛋白激酶，对细胞周期的运行发挥重要作用[1]。前期研究中发现gemcitabine（GEM）在诱导胰腺癌细胞发生凋亡过程中，Plk-1基因和蛋白的表达上调，表明Plk-1基因参与GEM诱导的胰腺癌细胞凋亡过程，与胰腺癌细胞对化疗药物的敏感性紧密相关[2]。本研究通过构建PlK-1真核表达载体，观察胞浆过表达PlK-1活性分子对化疗药物GEM诱导的胰腺癌AsPC-1细胞凋亡的影响及提高化疗敏感性作用，以期为胰腺癌的生物治疗协同化疗提供新思路。
　　1材料与方法
　　1.1试剂与仪器
　　1.1.1质粒、菌株、细胞株及主要试剂质粒提取试剂盒购自Promega公司，Lipofectamine2000脂质体转染试剂购自Invirogen公司，G-418购自Gibco公司，AsPC-1细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库，限制性内切酶（EcoRⅠ、NotⅠ酶）由Promega公司提供，小牛血清，RPMI1640培养基（Gibco公司），细胞总RNA提取试剂（Trizol）购自BBI公司，RNA酶A（RNaseA）及碘化嘧啶（PI）（Sigma公司），Trizol（MRC公司），DL2000DNAMarker，96孔板（Costar公司），琼脂糖（美国Merck公司），细胞裂解用蛋白酶抑制剂混合片（Roche公司），化学发光检测试剂盒（安玛西亚公司），逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒购自TaKaRa公司，NC硝酸纤维素膜购自ShleicherSchuell公司，GEM购自Pharmacia公司，兔抗人Plk-1多克隆抗体（美国Calbiochem公司），鼠抗人Plk-1单克隆抗体（美国Zymed公司），噻唑蓝（MTT）购自Amresco公司。其他常用试剂均为国产分析纯。
　　1.1.2仪器流式细胞仪（BeckmanCoulter），荧光显微镜（Leica）。
　　1.2克隆Plk-1基因并构建Plk-1过表达真核载体
　　引物设计与合成：根据美国NCBINucleotide公布的Plk-1引物序列：正义：上游引物5'-AAGAGATCCCGGAGGTCCTA-3'，下游引物5'-TCATTCAGGAAAAGGTTGCC-3'，产物长度450bp。人Plk-1mRNA全长序列（序列号AF262240）设计引物：正义5′-ACGAAGCTTATGGCGGCTCTGAAGAGTTGGCTGTCG-3′，下划线部分为HindⅢ酶切位点，反义：5′-CAGGGATCCTTTCAATCCTCACGCAGGTAGGCCTCC-3′，下划线部分为BamHⅠ酶切位点。提取AsPC-1细胞中总RNA，逆转录合成cDNA，加入合成的Plk-1引物进行PCR扩增。PCR反应体系为20μL，反应条件：95℃预变性3min，95℃变性10s，60℃退火40s，72℃延伸30s，共40个循环。将RT-PCR产物和pcDNA3.1载体用HindⅢ和BamHⅠ酶切、回收，连接构建pcDNA3.1/Plk-1重组质粒。
　　1.3细胞培养及基因转染
　　将AsPC-1细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，置37℃、5%CO2湿度为95%的恒温培养箱中培养，每隔2～3d传代1次，选择对数生长期细胞进行实验。用转染试剂GeneCompanionTMⅡ将空载体pcDNA3.1和重组载体pcDNA3.1/Plk-1转染AsPC-1细胞，方法按转染试剂说明书进行。
　　1.4目的基因表达的RT-PCR鉴定
　　将携带有人外源性Plk-1基因的真核表达质粒转染AsPC-1细胞系设为处理组，转染空载体设为对照组，无处理组设为空白组，提取转染24h后的细胞总RNA，逆转录后加入Plk-1检测引物进行PCR扩增。PCR反应体系为20μL，反应条件：95℃预变性3min，95℃变性10s，60℃退火40s，72℃延伸30s，共40个循环。
　　1.5目的基因表达的Westernblot鉴定
　　将携带有人外源性Plk-1基因的真核表达质粒转染AsPC-1细胞系设为处理组，转染空载体设为对照组，无处理组设为空白组，提取转染24h后，提取胞浆蛋白并定量，取各组等量蛋白进行SDS-PAGE电泳并转膜，5%牛奶封闭后依次加入一抗、二抗，用BCIP/NBT试剂盒显色，操作按说明书进行。
　　1.6四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞生长抑制率
　　取1×104AsPC-1细胞接种于96孔培养板，同上述方法进行基因转染24h后，分别加入不同浓度（2、5、10μmol/L）的GEM，将实验进行如下分组：①未加药+无转染组（空白组）；②加药+无转染组（对照组）；③加药+转染空载体组（空载体组）；④加药+转染N1/Plk-1组（实验组）；每组设3个复孔，继续作用24h，每孔加入20μLMTT（5mg/mL）继续培养6h，吸弃去培养液，加入150μLDMSO，酶标仪测定490nm处吸光度（A）值。根据3孔平均A值计算细胞生长抑制率（%）=（1-A实验组/A空白组）×100%。即处理组细胞抑制率（%）=（1-A处理组/A空白组）×100%；对照组细胞抑制率（%）=（1-A对照组/A空白组）×100%。
　　1.7流式细胞仪进行细胞凋亡分析
　　鉴定转染成功后，将实验进行如下分组：①未加药+无转染组；②未加药+转染空载体组；③未加药+转染N1/Plk-1组；④GEM+无转染组；⑤GEM+转染空载体组；⑥GEM+转染N1/Plk-1组，每组设3个复孔，5%CO2，37℃培养24h后，参照体内血药峰值浓度分别加入5μmol/LGEM，继续培养24h，胰酶消化收集细胞，1×106个细胞加入1mLDNA低渗缓冲碘化丙啶（PI）染液（0.1%柠檬酸三钠、50μg/mLPI、100μg/mLRnase），4℃避光作用30min，流式细胞仪检测DNA含量，凋亡细胞表现为亚二倍体凋亡峰。