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　　1.8统计学方法
　　采用统计软件SPSS10.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1Plk-1基因cDNA的克隆
　　琼脂糖凝胶电泳证实在AsPC-1细胞中成功地扩增了全长为450bp大小的Plk-1基因。见图1。
　　1：分子量标准；2：全长Plk-1基因
　　图1Plk-1基因cDNA的RT-PCR结果
　　2.2Plk-1真核表达载体的鉴定
　　RT-PCR结果证实挑取克隆酶切鉴定正确（泳道3）后测序结果与Genbank原序列对比结果一致，由此证明成功地构建了450bpPlk-1真核表达载体pcDNA3.1/Plk-1。见图2。
　　1：分子量标准；2：pcDNA3.1/HindⅢ+BamH；
　　3：pcDNA3.1/Plk-1/HindⅢ+BamH
　　图2pcDNA3.1/Plk-1真核表达载体HindⅢ
　　和BamHⅠ酶切鉴定结果
　　2.3目的基因表达的RT-PCR鉴定
　　以β-actin作为内对照，分别比较未转染组AsPC-1细胞组、转染空载体pcDNA3.1组及pcDNA3.1/Plk-1组24h各组细胞内Plk-1基因的mRNA水平，Plk-1mRNA相对量分别为（2.14±0.16）、（2.18±0.15）、（2.58±0.18），在数值上，转染pcDNA3.1/Plk-1组与其他各组相比，差异有高度统计学意义（P<0.01）（图3）。说明转染Plk-1基因的AsPC-1/Plk-1细胞组中Plk-1基因在mRNA水平表达水平明显升高。
　　M：分子量标准；1：AsPC-1细胞；2：AsPC-1/pcDNA3.1细胞；
　　3：AsPC-1/Plk-1细胞
　　图3RT-PCR鉴定各组细胞内Plk-1基因mRNA水平
　　2.4Westernblot鉴定细胞内Plk-1蛋白的表达
　　以β-actin作为内对照，比较分别AsPC-1正常细胞组、转染空载体pcDNA3.1组及pcDNA3.1/Plk-1组24h各组细胞内Plk-1蛋白的表达水平分别为（0.989±0.018）、（1.022±0.021）、（1.243±0.143），shPlk-1转染组Plk-1蛋白相对量相对较低，其中以shPlk-1-3转染组显著低于其它各组，差异有高度统计学意义（P<0.01）。转染pcDNA3.1/Plk-1组与其他各组相比，差异有高度统计学意义（P<0.01）（图4）。说明转染Plk-1基因的AsPC-1/Plk-1细胞组中Plk-1蛋白表达水平明显升高。
　　1：分子量标准；2：AsPC-1细胞；3：AsPC-1/pcDNA3.1细胞；
　　4：AsPC-1/Plk-1细胞
　　图4Westernblot鉴定各组细胞内Plk-1蛋白表达
　　2.5MTT法检测细胞生长抑制率
　　由图5可以看出，不同浓度GEM作用后，转染48hpcDNA3.1/Plk-1后的AsPC-1/Plk-1细胞生长抑制率明显高于空白AsPC-1细胞及转染空载体pcDNA3.1的AsPC-1/pcDNA3.1细胞，说明过表达Plk-1基因可以降低GEM对胰腺癌AsPC-1细胞的生长抑制作用。见表1、图5。
　　2.6胞浆过表达Plk-1抑制化疗药物诱导的AsPC-1细胞凋亡
　　流式细胞术细胞凋亡分析显示，5μmol/LGEM作用24h后，转染Plk-1基因的AsPC-1细胞出现明显的亚二倍体峰（图6），凋亡率明显低于未转染组及转染空载体组，其差异有高度统计学意义（P<0.01）；而空载体转染组与未转染组细胞凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）。
　　1：未加药+无转染组；2：未加药+转染空载体组；3：未加药+转染N1/Plk-1组；4：GEM+无转染组；5：GEM+转染空载体组；6：GEM+转染N1/Plk-1组；图中数据为凋亡率
　　图6GEM作用于各处理组AsPC-1细胞24h凋亡代表性
　　流式直方图
　　3讨论
　　胰腺癌是一种临床表现隐匿、发展迅速和预后不良的消化道恶性肿瘤，手术切除率仅为25%左右，化疗在胰腺癌的综合治疗中占有重要地位，顺铂、5-氟尿嘧啶（5-FU）作为胰腺癌常规化疗药物，其疗效并不令人满意[3]。
　　研究表明，绝大多数化疗药物是通过损伤细胞DNA诱导肿瘤细胞凋亡而起作用的[4]。肿瘤细胞凋亡与细胞周期检测点密切相关，当细胞周期检测点发生异常，经化疗药物发生DNA损伤的肿瘤细胞则不会发生凋亡，进入下一个运行周期继续增长，这正是肿瘤细胞对许多化疗药物不敏感的主要原因之一[5]。因此，如何恢复细胞周期检测点的正常功能，加强检测点关键调控（基因）蛋白对肿瘤细胞的正常监测（凋亡诱导）是增强化疗药物敏感性亟待解决的关键环节之一。