论文投稿_医学论文投稿_核心期刊,职称论文投稿发表_论文部落

　　2.2基因流分析

　　基因流是指生物个体从其发生地分散出去而导致不同居群之间基因交流的过程。植物的基因流主要靠花粉和种子的传播来完成[25-29]，基因流的大小直接影响着居群间遗传物质是否均质化以及遗传分化的程度，因此基因流是决定居群遗传结构的重要因素[30]，通过基因流可以了解居群过去的进化历史、掌握居群现在的遗传结构并预测居群将来的演化趋势，由此作出保护和可持续利用的有效策略。基因流的传统测定方法是通过收集器或染色跟踪花粉和种子的运动，但这些方法常常低估居群的基因流，而且也无法计算有效基因流的大小[31]。基因流可以通过亲本分析来测定[32]，采用亲本分析方法确定种子或幼苗的双亲之后，可以根据双亲之间的距离精确地测定花粉的传播距离，幼苗与母本间的距离（雌雄异株）或种子与双亲之间的平均距离（雌雄同株）即为种子散布距离。当花粉或种子从一个居群扩散到另一个居群，就形成居群间基因流，这种基因流是阻止居群遗传分化的重要进化因子。在后代的亲本分析中，有些后代的亲本不能由居群内的个体形成，根据这些后代的比率可以估算出居群间基因流与居群内基因流的相对强度。微卫星高度的多态性、共显性等特点，在亲本分析中具有突出的优势，目前利用微卫星对基因流进行的研究有很多[33-34]，但对药用植物基因流的研究基本没有，特别是药用植物在栽培过程中人为引起基因流改变而影响其进化潜能的研究还属空白，这直接关系到中药资源是否能可持续利用。

　　2.3进化显著单元ESU的划分

　　进化显著单元（evolutionarilysignificantunit，简称ESU）是地理上离散的、历史上被隔离的居群组，因而具有独特的进化潜力。定义ESU的遗传标准包括由遗传距离反映的等位基因频率的显著分化和基于某些基因的系统分化程度。定义ESU的主要目的是要确保进化的产物被认识并受到保护和有效利用，使不同ESU固有的进化潜能得以保持[35]，最终真正达到保护物种和可持续利用的目的。1986年，Ryder首次提出了进化显著单元的概念，用作保持生物遗传完整性和进化潜能的一种可操作方法，对地理上有显著变异的居群组进行分别管理[36]。然而，正如物种的概念一样，ESU在定义它的组成和界定它所要求的变异类型也还存在争议[35]。Moritz（1994）定义ESU为历史上被隔离的且独立进化的居群组[35]，这些居群组在动物中线粒体DNA（mtDNA）或植物叶绿体DNA（cpDNA）等位基因表现为交互单系，并在核等位基因上有显著分化。根据这一定义，在获取具有正确拓朴结构系统树的基础上可确定ESU。对于有显著遗传分化、同时在线粒体或叶绿体基因组和核基因组上都是单系的居群，应属独立的ESU。而对于与其他居群遗传分歧度并非很高、在线粒体或叶绿体基因组上又是单系的居群，如果其核等位基因的频率与其他居群有显著的差异，也应视为一个ESU；相反，如果其核等位基因的频率与其他居群没有显著的差异，则不能视为一个独立的ESU[37]。微卫星作为一种多态性很高的核基因分子标记，在界定显著遗传结构和定义进化显著单元具有其他分子标记不可替代的优势。进化显著单元ESU的研究目前主要集中在动物的保护遗传学研究[38]，在植物中也开始借鉴动物的研究方法进行一些进化显著单元的划分[39]，而在道地药材的保护、分子鉴定和可持续利用的研究中尚未深入到进化显著单元的划分。

　　3微卫星在道地药材群体遗传学研究中的应用展望

　　3.1微卫星在道地药材群体遗传学研究中的应用

　　近年来微卫星群体遗传学被生物科学界所重视，对于道地药材的研究主要集中在遗传结构和遗传多样性方面。如Chen等利用微卫星群体遗传学对唐古特大黄进行了遗传多样性和遗传结构分析，阐明了其濒危机制[40]；肖冬长等利用研究了铁皮石的遗传结构，揭示了品种间的亲缘关系[41]；郭银萍等研究了22份薏苡种质的遗传多样性，反映了供试材料的亲缘关系，从而为薏苡种质改良提供理论依据[42]；闫伯前等研究发现华中五味子具有较高的遗传多样性水平和较丰富的等位基因，可作为人工种植时优先选用的种质资源[43]。陈子易等应用微卫星标记实现了人参与西洋参的种间鉴别[44]。这些研究初步揭示了微卫星群体遗传学在道地药材研究中的优势，但前人的研究仅仅停留在遗传多样性和遗传结构方面，未能从根本解释道地药材的遗传变异和形成机制等问题，亟待在理论和方法上有所突破。

　　3.2微卫星在道地药材群体遗传学研究中的展望

　　3.2.1道地药材的遗传成因研究生物的表型是由遗传因素和环境因共同决定的，然而对于同一性状中的控制可能只是其中某一因素占主导作用引起的，比如欧洲人的平均身高要高于亚洲人是由遗传决定的，而中国北方人高于南方人的平均身高是由环境引起的。那么，道地药材的优质性究竟是由遗传因素还是环境因素所决定呢？这一直是道地药材研究争论的焦点。黄璐琦等提出了道地性形成的“边缘效应”[4]，他认为物种分布区边缘的极端环境有利于次生代谢产物的积累，因而物种分布区的边缘往往成为道地产区。其他的一些研究也表明次生代谢产物（如黄酮）含量的差异取决于药材的地理来源[45]。同时黄璐琦等又提出了“道地性越明显，其遗传分化越明显”的模式假说[4]，认为道地药材的生物学本质是同一物种特定居群与其他居群由于地理上的隔离而发生遗传分化的结果。这些争论一直没有直接的科学证据，使道地药材的生产和质量控制缺乏明确的标准。

　　在植物居群中，影响居群遗传变异地理分布的重要因素是基因流或溯祖关系[46]。植物的基因流是靠种子和花粉的传播来完成的，不同植物由于种子和花粉传播方式不同而各自具有独特的基因流模式，其顺畅与否，直接影响居群间的分化程度及遗传物质是否均质化[47-49]。溯祖关系是建立谱系分选（lineagesorting）现象的学说[50]，即祖先居群原始的基因型多态性由于遗传漂变逐渐消失，最终居群内仅存单一基因型而形成单系群，不同的单系群在相互隔离的情况下基因会因突变的积累而逐渐发生遗传分化。因此，现代基因流和谱系分选历史决定了一个物种居群的遗传结构，不同的遗传结构决定了居群表型（包括化学表型）的地理变异程度，从而在药材上反映出道地性的明显程度。因此，应用微卫星群体遗传学对居群遗传结构的研究，对道地居群与非道地居群间的遗传分化程度能够作出定量判断，结合化学表型地理变异进行相关性分析，能有效揭示遗传因素对道地性的影响程度，如果道地居群与非道地居群存在显著的隔离分化，那么道地性很可能是由遗传的因素所引起；反之则可能是由环境的因素所决定。

　　3.2.2道地药材的栽培起源研究药用植物的栽培是满足人们目前和将来对药用植物需求、缓解野生药用植物资源压力的有效途径，同时某些栽培方式，如传统小规模的就地引种，能够很好地保存植物的遗传多样性[51-52]。然而，栽培对药用植物资源的保护作用要从多方面来理解[53]，通过栽培而进行大规模的药用植物生产，对药用植物资源的保护也可能带来负面影响[54]，例如，奠基者效应和为了高产优质而进行的人工选择可能导致栽培药用植物狭窄的遗传背景，出现类似农作物驯化过程中出现的遗传瓶颈现象[55]。同时，在现代条件下的药用植物栽培，由于高度发达的交通和药材贸易市场，使得不同产地之间药用植物种子的交流变得更加容易，种子从原产地流入其他环境可能导致栽培药用植物远交衰退[56]，衰退的基因流可能从栽培居群流入附近的野生居群，从而引起野生居群对本地环境适应性的下降[57]。

　　栽培起源研究能够有效揭示栽培驯化过程中居群动态和遗传结构发生改变的过程，是当今国际上群体遗传学研究的热点之一。栽培植物和它们的野生祖先常常形成野生-栽培复合体并构成植物繁演的重要遗传资源[58-62]。伴随着农业上将植物从野生变为适合栽培和人类利用的引种驯化过程的开始，围绕着野生-栽培复合体的基础理论研究[60]（作为一种植物进化的模式）和应用研究也开始兴起，例如，确定驯化植物的地理起源或评价作物进化的居群动态可以为合理利用和管理遗传资源提供科学指导[61]。其中对野生和驯化两种形式下表型分化的遗传潜力研究尤为受到关注[62]，近来开始探测栽培的野生植物对附近自然居群的基因流[63]。所有这些研究是彼此相关的，例如，对居群进化历史的研究是分析人工选择作用[64]或基因流模式的前提[65]。目前栽培起源的研究多集中在对主要农作物的研究，如水稻、玉米、大豆等[66-68]，而药用植物的栽培起源研究基本上没有涉及，将微卫星群体遗传学引入道地药材的栽培起源研究，能有效揭示道地栽培居群是否起源于道地野生居群，并进一步比较它们的品质差异，最终阐明道地药材的栽培是否只有道地野生居群就地引种才能保持道地性、道地野生居群在非道地产区或非道地野生居群在道地产区异地引种对道地性的影响程度有多大、异地引种栽培居群的基因流对本地原生野生居群的种质可能产生的影响等科学问题，这些问题的解决必将把道地药材的栽培起源研究引向深入，充分掌握处于引种驯化初期的道地药材在人类干预下遗传演变的规律，为道地药材遗传资源的管理和合理利用及品种选育提供科学指导，避免在作物驯化过程中已经发生的不利于人类利用和植物进化的过程重演，有效地进行科学引种。

　　3.2.3道地药材的产地鉴别产地鉴别是指对不同产地的同一药材进行鉴别，道地药材具有特定的地域，寻找反映道地药材地域特征的鉴定评价标准一直是道地药材研究的关注点，然而道地药材的产地鉴别一直是药材鉴别的一大难题：一方面不同产地药材形态和组织差异很小，传统的经验鉴别和显微鉴别无能为力；另一方面不同产地药材的有效成分差异难以达到质的差别，同时受生长年限和取样时间等的影响，也很难勾画出同种药材不同产地的化学特征。那么，DNA分子鉴别能否解决这一难题呢？关于道地药材的DNA分子鉴定，肖小河等指出“目前DNA分子遗传标记技术在道地药材鉴定中受到2个方面的局限：一是来自技术本身的，如目标基因的真实性与DNA同源性，DNA分子标记结果的重现性和稳定性；二是来自研究对象的，不是所有的道地药材形成都会留下DNA差异‘烙印’，同时这种DNA差异也不见得与道地性的形成有直接或内在的相关”[69]。近来迅速发展的DNA条形码技术很好地解决了第一方面的局限，而无法解决第二方面的局限，其主要集中在物种水平的分类和鉴定，在药材鉴定方面的应用只能作真伪品的鉴别，其所依据的理论是分子系统学（phylogeny），所选用的DNA片段相对保守，实验也证明DNA条形码对当归这类药材的产地鉴别是无效的[70]。

　　道地药材的产地鉴别实质上是生物种下居群水平的遗传分化问题，所依据的理论是分子谱系地理学（phylogeography）和群体遗传学，所选用的DNA片段相对于用于物种水平鉴别的DNA条形码具有更快的进化速率。目前很多研究表明，叶绿体基因间序列在许多植物类群中已经显示了充分的变异，可用于植物分子谱系地理分析和进化显著单元的确定[71-72]，在药用植物的道地居群和非道地居群间也存在显著分化，具有道地居群特有的单倍型可用于产地鉴别[70，73]。叶绿体分子谱系地理分析反映了居群间种子流的大小和母系遗传DNA的分化程度，而控制化学表型的功能基因存在于核基因中，其分化程度与道地性的相关性更大。核基因在居群间通过花粉流传递，为双亲遗传。然而由于功能基因多存在高度保守、多拷贝、杂合等特点，直接利用功能基因进行群体遗传学分析难度较大，没有可操作性。微卫星特有的优势全面反映了核基因组的遗传信息，用于群体遗传学分析能有效阐明居群间花粉流的大小、核基因的分化程度、基因型纯合或杂合程度等，从而揭示核基因的居群遗传结构。只有同时考虑叶绿体DNA和核基因的居群遗传结构，才能正确划分进化显著单元，由此判断道地居群和非道地居群是否存在隔离分化或基因流，也即道地药材的形成是否留下了DNA差异的‘烙印’，最终阐明道地药材能否实现产地鉴别。对于没有DNA差异‘烙印’的道地药材不能实现产地鉴别；对于存在DNA差异‘烙印’的道地药材，根据分子谱系地理学和微卫星群体遗传学分析的结果建立道地药材的分子地理标识，从而实现道地药材的产地鉴别。

　　4结语

　　目前道地药材形成规律的研究已取得阶段性成果，但在道地药材形成的演化规律以及人工驯化过程人为影响道地药材进化潜能等方面的研究需要进行种内进化（微进化）的深入研究，将微卫星群体遗传学引入道地药材研究，突破了道地药材遗传成因研究长期在理论和方法上的局限以及药材分子鉴别停留在真伪鉴别（种间鉴别）的瓶颈，有效填补道地药材栽培起源研究的空白，为揭示道地药材的遗传成因、实现道地药材栽培科学的引种和产地鉴别（种内鉴别）提供新的理论和方法。

　　虽然微卫星是研究道地药材非常理想的遗传标记，但在实际的应用中仍有不足之处，除了一些已知大量序列信息的研究对象以外（如人类，常规的实验动物和一些农作物），对于一个序列信息完全未知的新种，必须首先建立基因文库并筛选微卫星位点，实验工作繁琐且耗时费力。微卫星位于非编码区的概率比编码区高，因此在某些情况下不能反应出功能基因组范围内的遗传水平。总之，随着实验技术的改进，统计分析方法和检验手段的日趋完善，微卫星群体遗传学将在道地药材研究中发挥更大的作用，在具体科研中应该针对需要解决的问题，选择合适的分子标记和分析方法，才能更好的解释道地药材的本质。

　　[参考文献]

　　[1]谢宗万.论道地药材[J].中医杂志，1990，40（10）：43.

　　[2]黄璐琦，张瑞贤.“道地药材”的生物学探讨[J].中国药学杂志，1997，32（9）：563.

　　[3]黄璐琦，郭兰萍，胡娟，等.道地药材形成的分子机制及其遗传基础[J].中国中药杂志，2008，33（20）：2303.

　　[4]黄璐琦，陈美兰，肖培根.中药材道地性研究的现代生物学基础及模式假说[J].中国中药杂志，2004，29（6）：494.

　　[5]邹喻萍，葛颂，王晓东.系统与进化植物学中的分子标记[M].北京：科学出版社，2001：1.

　　[6]AsheyMV，BDDow.Theuseofmicrosatelliteanalysisinpopulationbiology：backgroud，methodsandpotentialapplication[M]//SchierwaterB，BStreit，GPWagner，etal.Molecularecologyandevolution：approachesandapplications.Switzeland：BirkauserVerlagBasel，1994：185.

　　[7]BeckmanJS，JLWeber.Surveyofhumanandratmicrosatellite[J].Genomics，1992，12：627.

　　[8]LagdgerantzU，HEllegren，LAndersson.Theabumdanceofvarioouspolymorphicmicrosatellitemotifsdifferbetweenplantsandvertebrate[J].NucleicAcidsRes，1993，21：1111.

　　[9]PrimmerCR，APMeller，HEllegen.Awiderangesurveyofcross-speciesmicrosatelliteamplificationinbirds[J].MolEcol，1996，5：365.

　　[10]EstoupA，BAngers.Microsatellitesandminisatellitesformolecularecology：theoreticalandempiricalconsiderations[M]//CarvalhoGR.Advancesinmolecularecology.Amsterdam：IOSPress，1998：55.

　　[11]GuptaPK，RKVarshney.Thedevelopmentanduseofmicrosatellitemarkersforgeneticsanalysisandplantbreedingwithemphasisonbreadwheat[J].Euphytica，2000，113：163.

　　[12]LuikartG，PREngland.StatisticalanalysisofmicrosatelliteDNAdata[J].TrendsEcolEvol，1999，14：253.

　　[13]HamrickJL，GodtMJW.Effectsoflifehistorytraitsongeneticdiversityinplantsepicies[J].PhilosTransRSocLondon，SerB，1989，351：1291.

　　[14]GaudeulM，TaberletP，Till-BottraudI.Introductiontoconservationgentics[M].UK：CambrigeUniversityPress，2002.

　　[15]李建辉，金则新，楼文燕，等.东南石栎种群在演替系列群落中的遗传多样性[J].生态学杂志，2007，26：169.

　　[16]LedigFT，MTConkle.Genediversity，geneticstuctureinanarrowendemie，Torreypine[J].Evolution，1983，37：79.

　　[17]WaitsLP，GLuikart，PTaberlet.Estimatingtheprobabilityidentiyamonggenotyopesinnaturalpopulations：cautionsandguidelines[J].MolEcol，2001，10：249.

　　[18]ProcacciniG，OrsiniL，RuggieroMV，etal.SpatialpatternsofgeneticdiversityinPosidoniaoceanica，anendemicMediterraneanseagrass[J].MolEcol，2001，10：1413.

　　[19]GreenJM，BarkerJHA，MarshallEJP，etal.MicrosatelliteanalysisoftheinbreedinggrassweedBarrenBrome（Anisanthasterilis）revealsgeneticdiversityatthewithinandbetweenfarmscales[J].MolEcol，2001，10：1035.

　　[20]GustafssonS.PatternsofgeneticvariationinGymnadeniaconopsea，thefragrantorchid[J].MolEcol，2000，9：1863.