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摘要：为明确‘红阳’猕猴桃果肉中花青素含量在季节性温度下的合成变化情况及花青素合成酶基因ＡｄＡＮＳ表达的变化，以‘红阳’主产区四川蒲江和湖北武汉的‘红阳’猕猴桃为研究对象，测定其花青素的含量并克隆花青素合成基因ＡｄＡＮＳ，并对其转录水平变化进行检测。结果表明，较高的季节性温度对果肉花青素的含量有抑制作用，在温度适宜的蒲江，ＡｄＡＮＳ基因的表达水平与花青素积累变化相一致，而在高温的武汉其表达水平受到明显的抑制。

 

　　关键词：‘红阳’猕猴桃；花青素；温度波动；ＡｄＡＮＳ基因

 

　　猕猴桃（ＡｃｔｉｎｉｄｉａｃｈｉｎｅｎｓｉｓＰｌａｎｃｈ）驯化栽培至今已有１００余年的历史［１］，因其具有独特的风味和丰富的营养而受到广大消费者的喜爱。尤其是‘红阳’猕猴桃以其果实中心有放射状红色条纹，富含花青素而成为近年来消费者的新宠。但该品种不耐夏季高温干旱，特别是果肉红色易受夏季温度和湿度的影响，田间观察发现，在夏季温度较高的武汉种植的‘红阳’猕猴桃果肉的颜色非常淡，严重影响果实的商品价值［２］。

 

　　温度是影响植物组织中花青素积累的一个非常重要的环境因子，研究表明低温会诱导花青素的合成，而高温（３０～４０℃）下果实中的花青素很难形成［３，４］。温度对花青素合成的影响发生在其合成途径的多步反应中，在上游途径中，温度主要对苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）、查耳酮合成酶（ＣＨＳ）、查耳酮异构酶（ＣＨＩ）和黄烷酮-３－羟化酶（Ｆ３Ｈ）等的基因进行调控，而对下游的调控主要通过对二氢黄酮还原酶（ＤＦＲ）、花青素合成酶（ＡＮＳ）和类黄酮糖苷转移酶（ＵＦＧＴ）等的基因进行调控［５］。然而，目前为止，在‘红阳’猕猴桃果实发育期间，即季节性温度变化下果实中花青素含量的变化及与花青素合成基因的关系还未见报道。为此，试验对四川（‘红阳’主产区）和武汉‘红阳’猕猴桃果实发育期间花青素含量及花青素合成酶基因（ＡｄＡＮＳ）的变化情况进行研究，以期为温度对花青素含量的影响及为提高‘红阳’猕猴桃果肉的花青素含量提供科学依据。

 

　　１材料与方法

 

　　１．１试验材料

 

　　试验所用材料为２０１２年四川蒲江（中兴农业科技有限公司提供）和湖北武汉（武汉植物园猕猴桃园）种植的有相同遗传背景的‘红阳’猕猴桃植株，各３株。从坐果到果实收获整个果实发育期均不施用任何植物激素及肥料。

 

　　每次每株取３个果实取样后用冰浴保温箱带回实验室，取有花青素积累的靠近种子的果肉，在液氮中速冻，－７０℃保存备用。

 

　　１．２试验方法

 

　　１．２．１‘红阳’猕猴桃发育过程中温度的测定以当地气象局提供的当日天气条件为准，分别记录武汉及四川蒲江‘红阳’猕猴桃种植区从花后6０ｄ到成熟收获（花后１３６ｄ）的日最高和最低温度，考察‘红阳’猕猴桃生长期间温度的变化。

 

　　１．２．２‘红阳’猕猴桃果肉花青素的提取及测定果肉在液氮中研磨至粉末，然后用５倍体积的甲醇／水／乙酸（体积比８０∶２０∶１）提取，以锡箔纸包裹遮光，在摇床中２８℃、２００ｒ／ｍｉｎ提取３０ｍｉｎ，于４℃冰箱中放置２４ｈ，以０．４５μｍ的滤纸过滤留上清液，５０℃旋转蒸发浓缩备用［６］。

 

　　以美国Ｗａｔｅｒｓ公司的Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５液相色谱仪进行测定，Ｃ１８柱（Ｎｏｖａ－ｐａｋ）规格为１５０ｍｍ×３．９ｍｍ，颗粒度４μｍ。流动相Ａ为１％的甲酸，Ｂ相为乙腈，流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ，５３０ｎｍ处检测。

 

　　花青素标准品为ｃｙａｎｉｄｉｎｇ３－Ｏ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＣｈｒｏｍａｄｅｘＵＳＡ，ＣＡＳＮｏ．２７６６１－３６－５）和ｃｙａｎｉｄｉｎｇ３－Ｏ－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（ＷＡＫＯ，Ｊａｐａｎ，ＣＡＳＮｏ．７０８４－２４－４）。

 

　　１．２．３‘红阳’猕猴桃ＲＮＡ的提取及检测采用改良的ＣＴＡＢ法提取ＲＮＡ［７］。试验所用到的研钵、研杵、镊子、药匙等均于１８０℃灭菌４ｈ，离心管及枪头均采用无ＲＮＡ和ＤＮＡ酶的一次性耗材。

 

　　ＲＮＡ提取后，以１％的琼脂糖凝胶电泳对所提取的ＲＮＡ进行完整性检测，以Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００分光光度计检测ＲＮＡ浓度及Ａ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍ。

 

　　１．２．４ＡｄＡＮＳ基因的克隆、验证及序列分析根据已有猕猴桃ＥＳＴ序列及猕猴桃基因组测序结果，以ｃＤＮＡ为模板克隆得到一个花青素合成基因ＡｄＡＮＳ，将ＰＣＲ产物纯化回收后连接ｐＥＡＳＹ载体由北京全式金生物技术有限公司测序，与已报道的其他物种中的同源基因序列利用进化树分析软件ＭＥＧＡ（Ｖ５．０２）进行分析。

 

　　根据ｃＤＮＡ序列设计特异性引物，将每个果实单独提取ＲＮＡ后再等量混合，反转录成ｃＤＮＡ后进行ＲＴ－ＰＣＲ。

 

　　实时荧光定量ＰＣＲ条件：１．５μｇ总ＲＮＡ以ＦａｓｔＱｕａｎｔＲＴｋｉｔ（ｗｉｔｈｇＤＮａｓｅ）（ＴＩＡＮＧＥＮＢｉｏｔｅｃｈ）（北京）进行反转录合成第一链ｃＤＮＡ。１μＬｃＤＮＡ模板，１０μＬＳＹＢＲ?誖ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭ（ＤＲＲ０４１Ａ，Ｔａｋ

 

　　ａｒａ），０．２μｍｏｌ／Ｌ正反向引物，ＲＴ－ＰＣＲ在ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＳｔｅｐＯｎｅＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）仪上进行，每个基因３次重复，以基因ＡｄＡｃｔｉｎ（ＧＩ∶１４９９３８９６３）在７０ＤＡＡ处的值作为标准。

 

　　扩增程序为９５℃３０ｓ；９５℃５ｓ，５５～６０℃２０ｓ，４０个循环；７２℃２０ｓ。溶解曲线程序为９５℃１５ｓ，５５～９５℃在１ｍｉｎ内以０．３℃递增，再９５℃１５ｓ。

 

　　２结果与分析

 

　　２．１‘红阳’猕猴桃生长期间四川蒲江和湖北武汉的温度变化

 

　　在整个猕猴桃果实发育期，四川蒲江与湖北武汉温度测定结果（图１）显示，花后６０～１３６ｄ，武汉日最高温平均为３３℃，而四川蒲江为２９℃；温度高于３４℃的累积天数武汉为２７ｄ，而蒲江只有９ｄ。在武汉日最高温平均高于３４℃的生长阶段有三段，第一阶段为花后６７～７２ｄ，日最高温平均３４．５℃；第二阶段为花后８８～９９ｄ，其中有５d（95～９９ｄ）连续温度高于３６℃；第三阶段为花后１１４～１18ｄ，日最高温平均为３５．２℃，而蒲江只在花后１０２～１０４ｄ出现了３ｄ的高温（＞３５℃）。

 

　　２．２‘红阳’猕猴桃果实发育期间花青素变化趋势

 

　　在温度适宜的四川蒲江，‘红阳’猕猴桃果实花青素的变化（图２）显示，果实刚开始形成时子房中有红色，而后经历了消失—开始累积—高峰—部分降解的变化过程。花后３０～６０ｄ，原来子房中的花青素全部消失退净，直到花后６０ｄ在果实中隐约出现红色丝状花青素的累积，而后花青素积累呈增加趋势，到花后１００ｄ果实中花青素的浓度达到最高，为５６．９μｇ／ｇ（以鲜重计，下同），此后，花青素的含量呈下降趋势。而湖北武汉‘红阳’猕猴桃果实中花青素的含量只是在刚刚坐果时比较高，发育后期花青素含量不太高且没有明显的积累期，这可能与其生长期间的３次高温有关，最终花青素含量（５．９μｇ／ｇ）只有蒲江花青素含量（３１．３μｇ／ｇ）的１／５不到，表明花青素含量可能对温度的变化比较敏感。

 

　　２．３ＲＮＡ质量及浓度检测

 

　　以１％的琼脂糖凝胶电泳对所提取的ＲＮＡ进行完整性检测（图３），发现提取的总ＲＮＡ均呈现两条清晰、无明显拖尾现象的条带，说明获得的总ＲＮＡ样品完整性较好。

 

　　其中ＲＮＡ浓度都比较高，且其吸光度要求达到：１．８≤Ａ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍ≤２．２，Ａ２６０ｎｍ／Ａ２３０ｎｍ≥１．８（表１）。高质量的ＲＮＡ为下一步ｃＤＮＡ反转录、基因克隆及实时荧光定量ＰＣＲ提供了保证。

 

　　２．４基因克隆及测序结果

 

　　ＡｄＡＮＳ基因的ｃＤＮＡ序列全长为１２２０ｂｐ（图４），其开放阅读框为１０６８ｂｐ（１４２～１２０９ｂｐ），５′端非编码区为１４１ｂｐ，编码一个由３５５个氨基酸组成的多肽（图５），利用ＭＥＧＡ软件，将‘红阳’AdＡＮＳ编码的氨基酸序列与已发表的模式植物拟南芥、葡萄等的氨基酸全长序列进行比对，发现与红山茶（Ｃａｍｅｌｌｉａｃｈｅｋｉａｎｇｏｌｅｏｓａ）和葡萄（Ｖｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａ）中的ＡＮＳ进化关系最近，氨基酸序列相似性最高（图６）。

 

　　２．５ＡｄＡＮＳ在‘红阳’果实发育期间的表达模式

 

　　以ＡｄＡＮＳ的５′端设计实时荧光定量ＰＣＲ，序列特异性引物如下：

 

　　Ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ（５′→３′）：ＡＡＡＴＧＧＴＧＧＣＡＡＣＡ

 

　　ＧＴＧＧＴＣＧＧＡＡ

 

　　ＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒ（５′→３′）：ＧＧＧＣＣＡＴＴＣＴＣＣＴＴＣ

 

　　ＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴ

 

　　猕猴桃AdＡｃｔｉｎ（ＧＩ：１４９９３８９６３）基因序列特异性引物如下：

 

　　Ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ（５′→３′）：ＴＧＡＧＡＧＡＴＴＣＣＧＴＴ

 

　　ＧＣＣＣＡＧＡＡＧＴ

 

　　Ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ（５′→３′）：ＴＴＣＣＴＴＡＣＴＣＡＴＧＣＧＧＴＣＴＧＣＧＡＴ）

 

　　实时荧光定量ＰＣＲ结果表明（图７），AdＡＮＳ基因扩增曲线的Ｃｔ值为２２～２６，而溶解曲线呈现单峰,表明扩增的特异性好。从图８可以看出，在蒲江7０～10０ｄ，ＡｄＡＮＳ的表达量增加了9倍左右，而后表达量逐渐降低，但是花青素的净积累仍在增加，花后１1０ｄ花青素的净积累停止。花青素的净积累停止后可能又有降解发生，可能和温度及果实发育均有关。ＡｄＡＮＳ随后也保持较低的水平。而在武汉，总体来说与花青素积累量变化较小，与其相一致的是ＡｄＡＮＳ的表达水平变化也非常小（小于１．５倍）。花后110ｄ时，ＡｄＡＮＳ的表达是花后１００ｄ时的１．４倍，而后迅速下降，花后９０～１１０ｄ，ＡｄＡＮＳ的表达趋势与花青素积累增加变化趋势相一致。而１１０～１３６ｄ，花青素的积累量呈先减少再小幅增加的趋势，而ＡｄＡＮＳ的表达也与花青素的积累变化相一致，先减小后增加。结果表明，无论在何种温度状态下，花青素合成基因ＡｄＡＮＳ的表达变化都与花青素的积累变化相一致。

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