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　　1.4 血清学检测 各组大鼠经以上药物处理后，2%戊巴比妥钠腹腔麻醉，下腔静脉取血，分离血清，使用酶联免疫吸附（ELISA）法检测血清雌二醇和内皮素含量。硝酸还原酶法检测一氧化氮（NO）水平。以上试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。 

　　1.5 主动脉血管内皮功能的检测 分离各组大鼠的主动脉，置于预冷的Kerb’s液中。将附着动脉的结缔组织剥离后，切制为宽约3 mm的动脉环形标本。在含Kerb’s液的37℃浴槽中，将动脉环悬挂，另一端连于张力换能器，并持续给予 95%O2+5%CO2的混合气。张力换能器连接于Powerlab生物信号系统，记录和分析动脉环张力变化情况。当动脉环稳定于基线后，浴槽中加入去甲肾上腺素（NE，106mol/L）收缩血管环，待动脉环收缩达平衡状态后，分别加入浓度为（109～105）mol/L的内皮依赖性血管舒张剂乙酰胆碱（ACh），观察血管的舒张反应。然后，洗脱血管，重新平衡至基线，改用累加浓度为10-9～10-5mol/L的非内皮依赖性血管舒张剂硝普钠（SNP）重新舒张血管，测定各组非内皮依赖性血管舒张功能。 

　　1.6 Western blot提取蛋白后Bradford 法测定蛋白含量。上样后，SDSAGE 凝胶电泳分离蛋白。电泳结束后，湿转法将蛋白从聚丙酰胺凝胶转移到硝酸纤维素膜。室温下，脱脂奶粉（5%）封闭2 h。兔抗内皮型一氧化氮合酶一抗（1∶500），4℃ 孵育过夜。TBS漂洗3 次后，加入标记辣根过氧化物酶的IgG二抗，室温孵育30 min。漂洗3次膜后，在暗室里加入ECL显色2 min，并曝光胶片（1 ～2）min，采用图像分析系统进行分析蛋白印迹结果。 

　　1.7 统计学处理 计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，使用sigmastat 3.0软件处理。 

　　2 结 果 

　　2.1 血清E2、ET和NO水平变化 卵巢切除12周后，OVX组大鼠的E2和NO水平较Sham组大鼠显著降低（P<0.01），ET水平显著增高（P<0.01）。术后给予葛根异黄酮干预后，OVX+TIPL和OVX+TIPH组大鼠的E2、ET和NO水平与OVX组间均有统计学意义（P<0.01）。 

　　2.2 血管舒张反应变化 在Sham组，加入浓度为（109～105）mol/L的内皮依赖性血管舒张剂乙酰胆碱后，动脉环呈现浓度依赖性舒张；而在OVX组，动脉环对乙酰胆碱的舒张反应出现显著性障碍（P< 0.01）。给予葛根异黄酮干预后，与OVX组相比，OVX+TIPL和OVX+TIPH组的动脉环对乙酰胆碱的舒张反应显著性增高（P<0.05，见图1A）。使用浓度为109～105 mol/L的非内皮依赖性血管舒张剂硝普钠舒张血管，各组血管环对硝普钠的舒张效应无统计学意义（见图1B）。

　　3 讨 论 

　　血管内皮细胞是血管腔表面的单层上皮，形成血管的内壁。其不仅是循环血液与血管平滑肌间的屏障，也是人体重要的内分泌器官。血管内皮细胞受损是心血管疾病早期事件之一，也是多种心血管疾病形成的关键病理特征。在正常和受损状态下，内皮细胞可分泌多种血管活性物质，如内皮素、血管紧张素Ⅱ、血栓素A2、一氧化氮、前列环素、缓激肽等[5，6]。其中，一氧化氮和内皮素是关键的活性分子。动脉内皮功能受损时，一氧化氮的合成和释放减少，内皮依赖性的舒张功能出现下降。用乙酰胆碱诱导的内皮舒张反应是评估血管内皮舒张功能的经典方法[7]。乙酰胆碱对正常的动脉表现为舒张反应，而在内皮功能受损时则出现舒张反应降低或出现收缩反应。本研究结果显示，与对照组比较，去卵巢大鼠的内皮依赖性舒张反应显著下降，而不同剂量的葛根异黄酮可以不同程度的改善受损的内皮依赖性舒张反应，其中150 mg/kg葛根异黄酮作用较强。另外，LNAME预处理可明显阻断葛根异黄酮对去卵巢大鼠血管的舒张反应，提示葛根异黄酮增加去卵巢大鼠主动脉血管的舒张反应依赖于一氧化氮。而血清检测也发现，葛根异黄酮可以显著增加去卵巢大鼠的一氧化氮水平，并降低内皮素的含量。这说明葛根异黄酮可以显著改善去卵巢大鼠受损的内皮功能，具有保护血管内皮的作用。 

　　雌激素受体可表达分布于动物和人的血管内皮细胞、平滑肌细胞[8]。雌激素替代治疗可改善绝经期妇女血管内皮细胞的内分泌功能，调节血管的舒张功能，并可增加一氧化氮合酶的转录和表达，促进一氧化氮的合成和分泌，提高一氧化氮的活性。表明雌激素可以通过一氧化氮途径改善受损血管内皮介导的舒张反应。已有研究发现异黄酮genistein和大豆黄酮等对雌激素受体的选择作用比雌二醇高（2～10）倍左右，大豆黄酮是葛根异黄酮的成分之一[9]。因此葛根异黄酮可能通过雌激素受体直接影响动脉内皮功能。葛根异黄酮可以显著增加去卵巢大鼠的雌激素水平。这说明葛根异黄酮改善内皮功能与其类雌激素样作用有关。 

　　本研究发现去卵巢大鼠的内皮细胞eNOS的表达降低，而葛根异黄酮可以上调异常的eNOS表达。eNOS表达于血管内皮细胞，可以在LArg和分子氧为底物下合成一氧化氮，调控内皮功能。该结果提示葛根异黄酮也可以通过直接或间接影响eNOS表达，发挥内皮保护效应。葛根异黄酮具有保护去卵巢大鼠血管内皮的功能，其机制与类雌激素样作用、上调eNOS表达和降低内皮素水平等因素有关。 

　　参考文献： 

　　[1]Valdiviezo C，Lawson S，Ouyang P.An update on menopausal hormone replacement therapy in women and cardiovascular disease[J].Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes，2013，20（2）：148155. 

　　[2]Hage FG，Oparil S.Ovarian hormones and vascular disease[J].Curr Opin Cardiol，2013，28（4）：411416. 

　　[3]李响，万建波，李铭源，等.葛根异黄酮类化合物抗动脉粥样硬化药理研究进展[J].中国新药杂志，2010，19（8）：662665. 

　　[4]郑高利，张信岳，郑经伟，等.葛根异黄酮降低雌性去势大鼠血胆固醇水平[J].中药材，2002，25（4）：273275. 

　　[5]金香兰，姚兰春，焦润生.雌二醇对去卵巢大鼠血管内皮细胞功能的影响[J].齐齐哈尔医学院学报， 

　　2007，28 （1）：1113. 

　　[6]Meadows JL，Vaughan DE.Endothelial biology in the postmenopausal obese woman[J].Maturitas，2011，69（2）：120125. 

　　[7]Li Y，Cui X，Solomon SB，et al.Banthracis edema toxin increases cAMP levels and inhibits phenylephrinestimulated contraction in a rat aortic ring model[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2013，305（2）：H238250. 

　　[8]Knowlton AA，Lee AR.Estrogen and the cardiovascular system[J].Pharmacol Ther，2012 ，135（1）：5470. 

　　[9]Branham WS，Dial SL，Moland CL，et al.Phytoestrogens and mycoestrogens bind to the rat uterine estrogen receptor[J].J Nutr，2002，132（4）：658664.