时间:2015-05-11 10:26 文章来源:http://www.lunwenbuluo.com 作者:李江 点击次数:
【摘 要】 目的:优选升红颗粒提取纯化工艺的最佳条件。方法:处方中的鸡血藤和花生红衣用水提取,提取液浓缩后醇沉纯化。设计正交试验方法,以儿茶素、总黄酮含量为评价指标,对水提取工艺条件进行考察;以儿茶素、总黄酮转移率和浸膏得率为指标对醇沉纯化工艺条件进行考察。结果:水提取的最佳工艺条件为加水量为药材量的12倍,每次提取时间为1.5h,共提取3次;醇沉纯化的最佳工艺条件为浓缩液相对密度为1.10~1.15g/ml(30℃),含醇量为70%,静置时间36h。 结论:优选出的最佳工艺条件经验证其结果稳定,指标性成分含量高,可以用于投入生产。
【关键词】 升红颗粒;正交试验设计;儿茶素;总黄酮
Abstract:Objectice To optimize the conditions of the extraction and purification technique for Shenghong granules. Methods Herb Caulis Spatholobi and peanut coat in formulation were extracted by water decocting,and the condensed extracted liquid was purified by ethanol precipitating. Taking the content of catechin and total flavonoids as evaluation markers for the extraction technique of water decocting,and the transferring rate of the catechin and total flavonoids,and extract yield as evaluation markers for the purification technique of ethanol precipitating,each technique condition was evaluated by orthogonal design. Results The optimum condition of water decocting process was that the crude herb powder were decocted for 3 times with 12-fold water,1.5 hour each time. The optimum condition of ethanol precipitating process was that extracted liquid was precipitated 36 hours,which relative density was 1.10~1.15g/ml(30℃)and concentration of ethanol was 70% . Conlusions The repeated experimental results are stable on the optimum conditions, and the contents of components for markers are high. which could be used for enlarged production.
Keywords:Shenghong granule; orthogonal design; catechin; total flavonoids
升红颗粒是根据我院肿瘤科临床验方开发的纯中药复方制剂,由鸡血藤、花生红衣、大枣、枸杞子等药材组成,用于治疗肿瘤患者化疗诱导的血小板减少症。研究证实,鸡血藤和花生红衣均含有具有刺激造血祖细胞增殖作用的儿茶素类成分[1-2],而鸡血藤中的黄酮类成分也具有促进血虚动物模型造血功能的作用[3]。因此,在研究制剂工艺时以儿茶素含量和总黄酮含量作为考察提取纯工艺的指标。考虑到原方以水煎入药,且儿茶素和黄酮类成分在水、醇中的溶解性均较好,因此采用了传统的水提醇沉工艺路线,设计正交试验方法,对水煎煮提取和醇沉纯化两步骤的影响因素进行考察,对工艺条件进行优选,为升红颗粒制剂工艺的制定提供科学依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Agilent 1100 Series 高效液相色谱仪;Libra S32 紫外分光光度计(英国 Biochrom);RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);SHZ-Ⅲ循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂);FA2004电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。
1.2 试药 儿茶素对照品(批号:110877-201203,中国食品药品检定研究院);芦丁对照品(批号:100080-200707,中国食品药品检定研究院);甲醇、乙腈为色谱纯,其余试剂为分析纯;鸡血藤(批号:140201,安徽井泉集团中药饮片有限公司);花生红衣(批号:20130112,豪州成源中药饮片有限公司)。
2 方法与结果
2.1 高效液相色谱法测定儿茶素的含量[4]
2.1.1 色谱条件 色谱柱为Agilent HC-C18(4.6×250mm,5μm);流动相为水-甲醇-乙腈-冰醋酸(90∶5∶5∶0.4);检测波长280nm;流速0.8ml/min;柱温35℃。此条件下儿茶素色谱峰的保留时间为20.03min,理论塔板数为4169,分离度为19.03,拖尾因子为0.99。
2.1.2 标准曲线的制备 精密称定儿茶素对照品约10.0mg,置10ml容量瓶中,甲醇定容,配制成含量为0.98172mg/ml的对照品溶液。精密量取对照品溶液0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0ml分别置于10ml容量瓶中,甲醇定容,20μl进样测定,以进样量(X,μg)对色谱峰面积(Y)进行线性回归,回归方程为:Y=666049X-23116,相关系数r=0.9999,线性范围为0.098172~3.92688μg。
2.1.3 样品中儿茶素的含量测定 按正交试验设计各次实验规定的条件制备样品,精密量取规定体积的样品液,置蒸发皿中水浴蒸干,用流动相溶解,过滤后定容于25ml容量瓶,过0.45μm微孔滤膜后进样20μl测定峰面积,代入回归方程计算儿茶素的进样量,换算成鸡血藤和花生红衣药材总量中儿茶素的含量。
2.2 络合-分光光度法测定总黄酮含量[5-6]
2.2.1 标准曲线的制备 精密称定芦丁对照品约10mg,用50%的乙醇定容于50ml容量瓶,制成对照品溶液(0.1830mg/ml)。精密量取对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml分别置于25ml容量瓶中,各加50%乙醇使成5ml,再各加5%亚硝酸钠溶液1.0ml,摇匀,放置6min,各加10%硝酸铝溶液2.0ml,摇匀,放置6min;再各加4.3%氢氧化钠试液10ml,分别用50%乙醇稀释至刻度,摇匀,放置15min,制成待测对照品溶液。以第一瓶为空白对照,在510nm处测定各浓度对照品溶液吸光度,以吸光度(A)对浓度(C,mg/ml)进行线性回归,得回归方程C=0.0811A-0.0012(r=0.9995),线性范围为0.0183-0.0915mg/ml。
2.2.2 样品中总黄酮的含量测定 按正交实验设计各次实验规定的条件制备样品,精密吸取规定体积的样品液,置蒸发皿中水浴蒸干,用50%的乙醇溶解,过滤定容于100ml容量瓶中,精密量取0.0、1.0ml,分别置25ml容量瓶中,按照“2.2.1项”下的方法操作,过滤,取续滤液在510nm处测定吸光度,代入回归方程计算总黄酮的含量,换算成鸡血藤和花生红衣药材总量中总黄酮的含量。
2.3 浸膏得率的测定 精密量取25ml样品溶液,置于已干燥至恒重的蒸发皿中,水浴蒸干,105℃干燥至恒重,置于干燥器中冷却30min,迅速称重,换算成鸡血藤和花生红衣药材总量中浸膏得率。
2.4 工艺条件筛选的正交实验设计
2.4.1 水煎煮提取工艺 以加水量(A,以药材量的倍数计算)、煎煮时间(B,以沸腾时开始计时)、煎煮次数(C)作为试验因素,每个因素备选了3个水平,详见表 1。
利用L9(34)正交表安排实验,按2倍处方量称取鸡血藤、花生红衣药材粗粉适量,按各次实验因素水平的要求进行水煎煮提取,过滤后合并,定容于1000ml容量瓶,精密量取样品液20ml,置蒸发皿中水浴蒸干,按照“2.1.3”和“2.2.2”项下方法测定儿茶素和总黄酮含量。
2.4.2 醇沉工艺 水煎煮提取液中含有糖类、氨基酸、鞣质等水溶性杂质,造成收膏率高,影响后续的制剂成型和日服量,故考虑醇沉除杂。以浓缩液相对密度(D)、含醇量(E)、静置时间(F)作为实验因素,每个因素备选3个水平,条件见表2。
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