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牛黄清感胶囊对甲型H3N2流感病毒抑制和预防作用的实验研究
时间：2013-10-19 13:51 文章来源：http://www.lunwenbuluo.com 作者：常洋等 点击次数：
[摘要]目的检测牛黄清感胶囊对甲型A/Brisban/10/2008（H3N2）流感病毒抑制和预防的作用，为抗病毒药物的筛选、研发提供实验依据。方法在MDCK细胞培养内，采用病毒细胞形态变化CPE法、MTT染色法，检测不同浓度的牛黄清感胶囊对甲型A/Brisban/10/2008（H3N2）流感病毒的抑制和预防作用。实验分1次用药组和3次用药组，计算药物半数有效浓度IC50，最小有效浓度MIC及治疗指数TI。结果体外抑制甲型H3N2流感病毒实验中，"牛黄清感胶囊"单次用药组TI为27，三次用药组为TI为43。体外预防甲型H3N2流感病毒实验中，"牛黄清感胶囊"单次用药组TI为21.3，三次用药组为TI为27。结论体外抑制甲型A/Brisban/10/2008（H3N2）流感病毒的药效实验结果显示"牛黄清感胶囊"具有抑制和预防甲型流感病毒的作用。
[关键词]牛黄清感胶囊；甲型H3N2流感病毒；实验研究
[中图分类号]R285.5[文献标识码]A[文章编号]2095-0616（2013）16-27-04
甲流病毒是A型流感病毒，防治措施主要针对传播途径采取物理、行为预防及发病后对症治疗[1]。目前，抗病毒西药的种类较多，但对甲流病毒尚缺乏特效药物，在我国中医药已被纳入甲流的防治体系。该研究主要是检测牛黄清感胶囊对甲型H3N2流感病毒的预防作用。
1实验材料
1.1药物
1.1.1验证药物牛黄清感胶囊：国药准字Z20026054，每粒含0.3g生药，批号090962，生产日期：2009年12月2日，由黑龙江澳利达奈德制药有限公司提供。
1.1.2阳性药物对照利巴韦林注射液（病毒唑），0.1g/支，苏卫药准字（1988）第347003号：批号000223，苏州第六制药厂生产。
1.1.3细胞狗肾传代细胞（MDCK-P13），由全国流感中心提供。
1.1.4病毒甲型A/Brisban/10/2008（H3N2）流感病毒，批号：09712，由全国流感中心提供。
1.1.5实验室及其他实验材料生物安全三级实验室BSL-3：编号：CNAS/BLA/T003，由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所提供。其他实验材料还有来源华美公司的四甲基噻唑蓝（MTT）、D-MEM培养基（高糖含-谷氨酰胺，进口GIBCO）、胎牛血清（进口GIBCO）、牛血清白蛋白组分（进口GIBCO）、青酶素、链酶素、HEPES缓冲液（进口GIBCO）、TPCK-胰酶（牛胰腺来源VⅢ型，进口GIBCO）、Hank's溶液、二甲基亚枫（进口GIBCO）、倒置可视显微镜（OLYMPUS）、一次性实验耗材及试剂等（进口GIBCO公司）；3M公司的个人防护装备；本室的CO2培养箱NUAIRUSAUTOFLOW。
2实验方法
2.1牛黄清感胶囊对甲型A/Brisban/10/2008（H3N2）流感病毒抑制作用
2.1.1病毒CPE法
2.1.1.1细胞培养MDCK细胞以40万/mL的浓度接种96孔培养板，培养基为L-谷氨酸完全型D-MEM、10%的进口特级胎牛血清。37℃5%CO2孵箱培养至细胞对数生长期最旺盛75%～90%成片细胞，弃掉细胞培养液，采用Hank's溶液洗细胞2次。
2.1.1.2病毒吸附将100TCID50甲型A/Brisban/10/2008（H3N2）流感病毒（采用病毒生长液（D-MEM培养基中含牛血清白蛋白组分12.5mL、青酶素100U/mL、链酶素100μg/mL，HEPES12.5mL，TPCK-胰酶0.5mL）稀释后，接种经处理的MDCK细胞96孔培养板，每孔100μL，同时设病毒对照（100TCID50病毒液）。36℃、5%CO2孵箱中吸附2h，弃掉病毒稀释液，采用Hank's溶液洗2次。
2.1.1.3药物稀释牛黄清感胶囊，选用对细胞的最大无毒浓度（TD0）2倍稀释8个浓度即750～5.9μg/mL。同时设利巴韦林注射液阳性药物对照，选用对细胞的最大无毒浓度（TD0）2倍稀释9个浓度，即1000～3.9μg/mL，每浓度接种感染细胞3孔，每孔100μL。实验分1次用药组（不同浓度的药液作用被病毒感染的MDCK细胞1次），3次用药组（不同浓度的药液作用被病毒感染的MDCK细胞，每24小时弃掉旧药液，换同浓度的药液，连续3次）。36℃、5%CO2孵箱培养，每24小时在倒置显微镜下观察细胞形态CPE变化，以25%以下细胞形态CPE变化为"+"，26%～50%细胞形态CPE变化为"++"，51%～75%细胞形态CPE变化为"+++"，76%～100%细胞形态CPE变化为"++++"，至病毒对照出现"++++"时结束实验，用Reed-Muench法，计算药物半数有效浓度（IC50）和最小有效浓度（MIC）及治疗指数（TI）判断药效。实验重复3次。
2.1.2病毒MTT染色法
观察细胞病变CPE结果后，加入MTT5mg/mL，每孔10μL，置37℃培养4h，然后加入100μLDMSO有机溶剂，室温20min，充分溶解细胞（过程中稍加震荡）。然后，采用酶标仪波长570nm测定，记录OD值，计算药物半数有效浓度IC50和最小有效浓度MIC及治疗指数TI，判断药效。实验重复3次。
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