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　　2.2牛黄清感胶囊对甲型A/Brisban/10/2008（H3N2）流感病毒的预防作用

　　2.2.1病毒CPE法

　　2.2.1.1细胞培养按2.1.1.1的方法。

　　2.2.1.2药物作用细胞牛黄清感胶囊，选用对细胞的最大无毒浓度（TD0）2倍稀释8个浓度，即750～5.9μg/mL，同时设利巴韦林注射液阳性药物对照，2倍稀释9个浓度1000～3.9μg/mL，每浓度接种感染细胞3孔，每孔100μL。实验分1次用药组（不同浓度的药液作用被病毒感染的MDCK细胞1次），3次用药组（不同浓度的药液作用被病毒感染的MDCK细胞，每24小时弃掉旧药液，换同浓度的药液，连续3次）。

　　2.2.1.3病毒攻击将100TCID50甲型A/Brisban/10/2008（H3N2）流感病毒（采用病毒生长液（D-MEM培养基中含牛血清白蛋白组分12.5mL、青酶素100U/mL、链酶素100μg/mL，HEPES12.5mL，TPCK-胰酶0.5mL）稀释后，接种经药物作用的MDCK细胞96孔培养板，每孔100μL，同时设病毒对照（100TCID50病毒液），设正常细胞对照。36℃、5%CO2孵箱中吸附2h，弃掉病毒稀释液，采用Hank's溶液洗2次。

　　2.2.1.4细胞培养及观察每孔加入100μL病毒生长液，36℃、5%CO2孵箱培养，每24小时在倒置显微镜下观察细胞形态CPE变化，按2.1.1.3的指标判断药效。实验重复3次。

　　2.2.2病毒MTT染色法

　　按2.1.2的方法。

　　3实验结果

　　在MDCK细胞培养内，采用病毒细胞形态变化CPE法、MTT染色法，检测不同浓度的牛黄清感胶囊对甲型A/Brisban/10/2008（H3N2）流感病毒的预防作用。实验分1次用药组和3次用药组，用Probit回归法计算计算药物的半数有效浓度IC50，最小有效浓度MIC及治疗指数TI。3次实验结果见表2。

　　4讨论

　　流行性感冒一直是世界高发的传染病之一，每年全球约有6亿人患流感，占总人口的10%。我国是世界上公认的流感多发地甚至是发源地，其机制尚不清楚。其中曾经引起世界性大流行的A（H3N2）亚型流感病毒自1968年以来一直在人群中存在[2]。流感病毒的抗原变异与流感的发生和流行密切相关，流感病毒正是通过不断改变其抗原性来逃避宿主特异性免疫的识别和清除，从而不断引起流行[3-4]。

　　国内外有关抗病毒中药的研究日益增多，从中筛选其有效成分已成为当前抗病毒新药研发的一个热点[5]。牛黄是一种常用的名贵中药，味苦、甘，性凉。归心、肝经。具有清心解毒、凉肝息风、豁痰开窍等功效。现代药理学方法研究结果显示，生物牛黄中间体在鸡胚成纤维细胞上使新城疫系疫苗毒的TCID50升高1个滴度[6]。金银花具有清热解毒，凉散风热之功效，有研究[7]发现金银花具有明显的抗病毒作用，其有效活性成分为绿原酸类化合物，金银花的抗病毒

　　作用多是由其有效活性成分直接作用于病毒，对DNA和RNA病毒均有一定的抑制作用。金银花提取物20g/kg和40g/kg剂量组可明显延长甲型流感病毒感染小鼠的存活天数，显著降低甲型流感病毒感染小鼠死亡数，对甲型流感病毒（A/PR/8/34）感染小鼠具有明显的保护作用，同时可明显降低甲型流感病毒感染小鼠的肺指数值，具有减轻甲型流感病毒小鼠肺部病变的作用[8]。黄芩始载于《神农本草经》，为唇形科植物黄芩的干燥根，有清热燥湿、泻火解毒之效。黄芩具有多种药理作用，除抗氧化、清除自由基、抗炎、抗肿瘤作用外，对多种病毒，如乙肝病毒、HIV等均具有抑制作用[9]。目前研究认为，黄芩的有效成分是黄酮类化合物，研究表明黄芩苷对流感病毒所致的细胞病变作用有明显的抑制作用，可较强地抑制小鼠感染流感病毒及明显阻碍流感病毒对小鼠的致死活性，对流感病毒的唾液酸酶有特异的抑制活性，并抑制流感病毒的膜融合及脱壳[10]。连翘对多种病毒具有抑制作用，连翘抗病毒有效部位（LC-4）在体外对呼吸道合胞病毒（RSV）有明显的预防作用及治疗作用[11]。

　　牛黄清感胶囊是由牛黄、金银花、黄芩、连翘等组成的复方制剂[12]，我们对甲型H3N2流感病毒的实验结果表明牛黄清感胶囊具有体外抑制和预防高致病甲型H3N2流感病毒的作用，同浓度的稀释药液连续3次作用正常的MDCK细胞和被病毒感染的细胞，能够有效的抑制和预防高致病甲型H1N1流感病毒的繁殖。