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　　[摘要] 目的 观察由鱼藤酮制备的帕金森病（PD）大鼠模型黑质多巴胺能神经元中氧化应激参数、转录因子NF-E2相关因子（Nrf2）及其基因产物血红素氧合酶1（HO-1）和依赖还原型辅酶/Ⅱ醌氧化还原酶1（NQO1）的表达变化情况。 方法 将健康成年雄性Wistar大鼠40只随机分为对照组和实验组，20只对照组大鼠给予背部皮下注射葵花油[1 mL/（kg·d）]，20只实验组大鼠，按照2.0 mg/（kg·d）背部皮下注射鱼藤酮（鱼藤酮溶解在葵花籽油中）制备PD大鼠模型，共30 d。最后一次注射结束后实验大鼠迅速断头取材，采用分光光度法检测大鼠脑内纹状体中丙二醛（MDA）和还原型谷胱甘肽（GSH）含量变化，采用Western blot检测两组大鼠中脑黑质中Nrf2、HO-1和NQO1的表达。 结果 对照组和实验组脑内纹状体中MDA含量分别为（6.51±1.45）、（18.13±2.14）nmol/mgprot，与对照组比较，实验组大鼠纹状体中MDA升高了64.09%（P < 0.01）。对照组和实验组纹脑内状体中GSH含量分别为（44.53±4.71）、（26.41±2.52）mg/gprot，与对照组比较，实验组大鼠纹状体中GSH降低了40.69%（P < 0.01）。对照组大鼠中脑黑质中Nrf2、HO-1和NQO1与β-actin免疫印迹条带相对吸光度比值分别为（0.81±0.05）、（0.84±0.07）和（0.91±0.15），实验组大鼠中脑黑质中Nrf2、HO-1和NQO1与β-actin免疫印迹条带相对吸光度比值分别为（0.42±0.06）、（0.49±0.03）和（0.33±0.04）。与对照组比较，实验组大鼠黑质神经元中Nrf2、HO-1和NQO1表达分别降低了48.15%、41.67%和63.74%（P < 0.01）。 结论 氧化应激在PD发病中起着非常重要的作用，内源性抗氧化损伤通路Nrf2-ARE与PD的发病关系密切，可能是PD新的治疗靶点。

　　[关键词] 帕金森病；氧化应激；转录因子NF-E2相关因子-抗氧化反应元件；血红素氧合酶1；依赖还原型辅酶/Ⅱ醌氧化还原酶1

　　[中图分类号] R742.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）12（b）-0008-04

　　帕金森病（Parkinson's disease，PD）是中老年人群中较为常见的中枢神经系统变性疾病，其主要的特征性病理变化是中脑黑质多巴胺能神经元变性坏死及Lewy小体形成，导致脑内多巴胺神经递质含量减少，主要临床症状为运动障碍，表现为静止性震颤、肌张力增高、运动迟缓等。既往研究结果表明，许多慢性疾病都与人体内发生氧化应激导致体内累积过多的氧自由基有关，氧自由基在PD中脑黑质多巴胺能神经元死亡过程中起着非常至关重要的作用，抗氧化治疗PD已成为新疗法中的重要研究方向[1-2]。

　　转录因子NF-E2相关因子（NF-E2-related factor 2，Nrf2）是细胞氧化应激反应中的关键因子，通过与抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）相互作用调节抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表达。Nrf2是机体调节抗氧化反应的重要转录因子，正常情况位于细胞浆中，在细胞浆中与Keapl结合形成复合体，且被泛素蛋白酶迅速降解，从而保持其低活性的生理状态。当机体受到氧自由基和内源性毒素等攻击后Nrf2与Keapl解离，其半衰期明显延长，然后转位进入细胞核，与抗氧化反应元件ARE结合后诱导抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶基因的表达。Nrf2-ARE通路是目前发现的最为重要的内源性抗氧化损伤通路之一。

　　血红素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）和依赖还原型辅酶/Ⅱ醌氧化还原酶1[NAD（P）H：quinone oxidoreductase-1，NQO1]是Nrf2-ARE通路编码的内源性保护基因，在抗氧化损伤方面起着重要作用。在中枢神经系统上调HO-1和NQO1的表达，能够减少氧自由基和内源性毒素对神经元的毒性作用。既往研究证实，激活Nrf2-ARE信号通路上调其基因产物的表达对神经系统疾病如癫痫、脑出血、脑梗死和脑外伤等，具有很强的神经保护功能[2]。但是，Nrf2-ARE信号通路在PD发病中表达改变还未见明确相关报道。本研究利用鱼藤酮制备PD大鼠模型，观察大鼠脑内黑质中Nrf2及其基因产物HO-1和NQO1的表达改变。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物分组和动物模型的制备

　　雄性Witstar大鼠40只，体重250～300 g，由河北医科大学实验动物中心提供。将40只Witstar大鼠随机分为对照组和实验组；20只对照组大鼠给予背部皮下注射葵花油1 mL/（kg·d），20只实验组大鼠，按照2.0 mg/（kg·d）背部皮下注射鱼藤酮（鱼藤酮溶解在葵花籽油中，充分震荡混匀后4℃避光保存），共30 d。大鼠饲养于昼夜交替的环境中，期间自由进食进水。

　　1.2 实验动物脑内纹状体中氧化应激参数丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）含量测定

　　最后1次药物注射结束后24 h，大鼠直接断头取脑，在冰盘上迅速分离纹状体，4℃生理盐水冲洗血液，液氮速冻，于-80℃低温冰箱保存用于测量氧化应激参数（MDA和GSH）。具体实验方法按所购试剂盒说明书进行。

　　1.3 Western blott检测两组大鼠中脑黑质中Nrf2、HO-1和NQO1的表达

　　最后1次药物注射结束后24 h，大鼠直接断头取脑，在冰盘上迅速分离黑质所在脑块，4℃生理盐水冲洗血液，入液氮速冻后置-80℃低温冰箱保存备用。取所需脑组织入4℃裂解液匀浆5 min，冰浴静置1 h，4℃ 2000 r/min离心5 min，取上清，Bradford法测定蛋白浓度。相关样品取50 μg总蛋白经10% SDS-PAGE凝胶电泳分离，电转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，依照实验目的分别加入5%脱脂奶粉稀释的兔Nrf2、HO-1和NQO1单克隆抗体（1∶1000），4℃过夜。PVDF膜以TTBS洗3次。山羊抗兔IgG 荧光抗体（1∶10000，Rocland公司）室温避光1 h，漂洗5次，远红外荧光扫描成像系统（Odyssey公司） 扫描并测定目标蛋白单位光密度值，与β-actin（1∶5000，Santa Cruz）比值后，做统计学分析。 

　　1.4 统计学方法医药卫生

　　采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 一般状况

　　与对照组相比，实验组大鼠毛色变黄、变脏，体态呈弓背状，行为上表现为主动活动减少、动作迟缓、步态不稳、行走时多向一侧旋转。两组在第10、13、15、19 d时各死亡1只大鼠。