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　　2.3 左旋紫草素对照品最大吸收波长的测定

　　取左旋紫草素对照品乙醇液，以乙醇为空白对照，在600～400nm波长范围内扫描，左旋紫草素对照品在516nm处有最大吸收。见图1。

　　2.4 样品紫外吸收图测定

　　取样品5g， 按“供试品溶液的制备”项下操作，在UV-2501紫外分光光度计上于600～400nm波长处扫描，516nm处有最大吸收。见图2。

　　2.5 缺紫草阴性样品对照液干扰试验

　　取缺紫草阴性样品5g，按“供试品溶液的制备”项下同法操作在UV-2501紫外分光光度计上于800～400nm波长处扫描，缺紫草阴性对照液在516nm处基本无吸收，且吸收度值极低，可忽略不计。

　　2.6 线性关系的考察

　　精密吸取对照品溶液1.4、2.8、4.2、5.6、7.0、8.4mL置25mL量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，以等量的乙醇液为空白对照，于516nm波长处测定吸收度。测定结果见表1。以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标绘制标准曲线。经线性回归，得回归方程：y=23.157x+0.0017，r=0.9999，左旋紫草素在5.64～33.87μg/mL范围内A与C呈良好线性关系。见图4 。

　　图4 左旋紫草素对照品标准曲线

　　2.7 样品含量测定

　　称取各样品5g，按“供试品溶液的制备”项下同法操作，测定各样品中左旋紫草素含量。

　　2.8 加样回收率试验

　　称取四季青软膏2.5g、左旋紫草素对照品4.03mg置小烧杯中，加硅藻土2.5g，搅匀后移至具塞锥形瓶中，加100mL乙醇，于50℃水浴中加热 ，超声40min，放冷，静置，滤过，取续滤液5mL加乙醇定容至25mL量瓶中，测定吸收度，同法操作6次，计算其回收率。

　　3 结果

　　3.1 样品含量测定

　　3批样品的紫草素含量分别为0.0169mg/mL（20121105），0.0167mg/mL（20121106），0.0162mg/mL（20121112）。见表1。

　　3.2 加样回收率试验

　　平均回收率为98.8092%，RSD（%）=0.8849。见表2。

　　3.3 精密度试验

　　取同一对照品溶液同法测定6次，结果RSD（%）=0.13%（n=6），表明仪器精密度良好。

　　3.4 重复性试验

　　称取同批（20121112）复方四季青油膏样品6份各5g，分别按“供试品溶液的制备”项下同法操作，测定各样品吸光度，计算其左旋紫草素含量，测定结果RSD（%）=2.2%（n=6），说明重复性良好。

　　3.5 稳定性试验

　　取同一供试品溶液，分别在0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，UV-2501型-紫外分光光度计上测定其吸光度，测得值RSD（%）=1.4%（n=6），表明供试品溶液在3h内基本稳定。

　　4 讨论

　　4.1 复方四季青软膏的提取方法

　　采用油煎法，在提取方法的研究中发现，若采用传统的一次提取法[12]，紫草的含量很低，而采用新的提取方法两次提取法（第一次单独用黄凡士林提取紫草，第二次将第一次留下的紫草残渣与其余药材再用黄凡士林提取一次），既不造成药材浪费，而且紫草含量大大提升，可高出一次提取法的两倍[13]。在复方四季青青软膏提取中还发现，不同产地与不同批次的紫草，含量差异较大， 无论是药材的剪碎还是在油煎的过程中，都对结果有着一定的影响。在整个试验中均需要用同一产地同一批次的紫草，以提高结果准确度。

　　表1 样品含量测定结果

　　批号 吸光度值 吸光度平均值 样品百分含量（%）

　　20121105 0.393 0.401 0.388 0.394 0.16

　　20121106 0.387 0.384 0.393 0.388 0.16

　　20121112 0.381 0.372 0.381 0.378 0.16

　　表2 加样回收率试验结果

　　样品号 样品含量 加入量 测得量 回收率（%） 平均回收率（%） RSD（%）

　　1 4.5149 4.03 8.4700 98.2675

　　2 4.5150 4.03 8.4780 98.2676

　　3 4.5100 4.03 8.4700 98.2600 98.8092 0.8849

　　4 4.5120 4.03 8.4900 98.7651

　　5 4.5100 4.03 8.4950 98.7690

　　6 4.5130 4.03 8.5670 100.5025

　　4.2 供试品的处理方法

　　采用醇提法。因紫草主含萘醌色素类物质，难溶于水，易溶于乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂。考虑到生产成本与实际生产情况，选择乙醇作为溶剂对复方四季青软膏进行处理。对于乙醇浓度及乙醇用量的选择，因2010年版《中国药典》一部中已明确指出用95%的乙醇提取进行药材含量测定，说明其羟基萘醌总色素在95%的乙醇中溶解最好，故本实验选用的是95%的乙醇对供试品进行处理。而乙醇的用量，经过试验发现，100mL乙醇可以充分溶解5g样品。本实验采用的是100mL 95%的乙醇来处理供试品。样品测定结果表明， 通过对样品颜色的观察发现，左旋紫草素含量高的成品颜色深红， 而所测含量较低的成品颜色浅紫， 这可能与紫草原药材的质量有关。

　　4.3 测定方法的选择

　　据有关文献报道紫草含量测定可采用高效液相色谱法、薄层扫描测定法及紫外-可见分光光度法。本试验采用的是紫外分光光度法来测定紫草的含量，结果试验的重现性及回收率均较好。

　　5 结论

　　经供试品提取方法试验考查， 用100mL 95%乙醇，超声提取40min， 供试液稳定， 试验的重现性及回收率均较好，且该方法简便，准确，可用于复方四季青软膏中紫草含量的控制。

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