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　　1.5.4 westernblot检测STAT3、Bcl-2与Caspase9蛋白实验步骤参照参考文献[7] 。Eca109 细胞按每孔106·mL-1 的密度接种于培养皿中，培养24 小时后，加入含启膈散提取物的1640 培养液，使药物终浓度分别为药物终浓度分别为1.47μg/ml 、33.26μg/ml，对照组加含相同浓度的DMSO 的1640 培养液，细胞培养48 小时后，冰上收集全部细胞，4℃PBS 洗，离心收集，加入含苯甲基磺酰氟（PMSF）的总蛋白提取细胞裂解液，冰上裂解1h，15000rpm，4℃离心10min，取上清液，-80℃保存。根据目的蛋白STAT3、Bcl-2、Caspase9 蛋白与内参β-tublin 的分子量大小，配制合适的下层胶（10%）和上层胶（5%），分别将20ug 蛋白提取物和5×上样缓冲液4ul 混合，终体积为20μl，将蛋白样品95℃加热变性5 分钟后，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳、转膜实验，5%脱脂奶封闭膜4℃过夜，一抗室温摇床封闭2h，TBST 洗6 次，每次5 分钟；二抗室温摇床封闭1 小时，TBST 洗6 次，每次5 分钟，加入ECL（ECL 有发射极耦合逻辑电路的意思,在化学领域,是一种化学发光试剂）超敏发光液，全能型凝胶成像分析系统拍照并分析。
　　1.5. 5 统计学分析 实验数据以x__±s 表示，使用SPSS 17.0 数据统计软件进行方差分析，再进行LSD-t 检验，测P﹤0.05 有统计学意义，回归分析进行曲线拟合，应用概率法计算半数抑制率。
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　　2. 结果
　　2.1 不同浓度启膈散乙酸乙酯提取物对Eca109细胞的生长抑制作用 启膈散乙酸乙酯部位各浓度组作用Eca109细胞48小时，体外有一定的抑制作用，呈现一定的量效关系（图1，表1），回归分析法得R2=0.906，F=14.457, Y= - 3.179×10-5x2+0.008 x+0.288，根据概率法得IC50=33.26。
　　IC35=1.47， IC70=76.52。
　　表1 六君子乙酸乙酯部位对食管癌Eca9706 细胞的生长抑制（x__盨D，n=5）
　　Table 1 Effect of Qige San ethyl acetate extract at different concentrations on theproliferation of human esophageal carcinoma Eca109 cells组别 剂量（μg/ml） OD 值 抑制率（%）
　　对照组 对照 1.21125±0.11813 ----
　　启膈散乙酸乙酯部位 10 0.849±0.17743※※ 29.91启膈散乙酸乙酯部位 20 0.581±0.09272※※ 52.33启膈散乙酸乙酯部位 40 0.5277±0.07239※※ 56.44启膈散乙酸乙酯部位 60 0.4597±0.01405※ 62.05启膈散乙酸乙酯部位 80 0.3587±0.1009※※ 70.39启膈散乙酸乙酯部位 100 0.262±0.06295※※ 78.37※：与对照组相比P<0.05.；※※：与对照组相比，P<0.012.2 启膈散乙酸乙酯部位对Eca109 细胞诱导凋亡的作用 用启膈散乙酸乙酯部位的高、中、低即1.47μg/ml 、33.26μg/ml、76.52μg/ml 三个浓度，抑制率分别为：35%、50%、70%，作用于Eca109 细胞48 小时后，处理组与对照组比较，凋亡明显增加，流式细胞仪检测结果如下：差异具有统计学意义（P<0.001，n=4）（表2）。
　　表2. 启膈散乙酸乙酯部位诱导Eca109 凋亡作用（x__盨D，n=4）
　　Table 2 Effect of Qige San ethyl acetate extract on the apoptosis of human esophagealcarcinoma Eca109 cells
　　组别 剂量（μg/ml） 凋亡率（%）
　　对照组 — 1.32?.36
　　启膈散乙酸乙酯部位低浓度 1.47 8.15?.25*
　　启膈散乙酸乙酯部位中浓度 33.26 13.47?.28*启膈散乙酸乙酯部位物高浓度 76.52 19.39?.88**：与对照组相比，P<0.01，n=4
　　2.3 westernblot检测STAT3、Bcl-2与caspase9的表达量 用不同浓度的启膈散乙酸乙酯部位作用Eca109细胞48小时后，收集细胞，提取总蛋白，westernblot检测STAT3、Bcl-2与caspase9的表达量。随着药物浓度的增加，STAT3和Bcl-2的表达量随着加入的启膈散提取物浓度的增加而逐渐降低，caspase9的表达量随着加入的启膈散提取物浓度的增加而逐渐增加，而内参蛋白β- tublin的表达量变化很小，表明启膈散乙酸乙酯提取物诱导Eca109细胞凋亡与抑制STAT3信号通路有关。（图1，表3）。
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　　STAT3 β- tublin
　　对照 启35% 启50% 启50% 启35% 对照
　　Bcl-2 caspase9
　　图1. 启膈散乙酸乙酯部位作用Eca109细胞后蛋白表达量的变化Figure 1 Effect of Qige San ethyl acetate extract on the protein expression of STAT3, Bcl-2and caspase 9 in human esophageal carcinoma Eca109 cells（其中，35%启是指抑制率为35%时的启膈散提取物浓度即 1.47μg/ml， 50%启是指抑制率为50%时的启膈散提取物浓度即33.26μg/ml）
　　表3. 启膈散乙酸乙酯部位诱导Eca109细胞STAT3、Bcl-2与caspase蛋白的表达的光密度值Table 3 Effect of Qige San ethyl acetate extract on the optical density of STAT3, Bcl-2 andcaspase 9 expression in human esophageal carcinoma Eca109 cellsSTAT3 Bcl-2 caspase9 β- tublin
　　对照组 1086.794 423.195 187.548 1331.888
　　启35%组 346.792 120.317 1507.837 7.7.572
　　启50%组 37.836 81.514 1972.181 362.877