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　　近年来的研究表明，高糖血症是糖尿病心肌病心肌纤维化的主要致损伤因素。除心肌细胞肥大外，心肌间质的重构及纤维化亦是糖尿病所致心肌病心室舒缩功能障碍的主要机制之一[1]。血糖浓度升高可导致心肌细胞Ⅰ型胶原合成和分泌明显增加，加重心肌的纤维化程度，进而加速心功能的恶化。过氧化物酶增殖激活物受体（PPAR-γ）是新近发现的在细胞分化领域起主要作用的转录因子，表达于血管壁与心肌组织[2]，它不仅能够调节糖和脂类物质的代谢，还参与了炎症反应、细胞衰老与凋亡、动脉粥样硬化过程中的平滑肌迁移与增殖等病理生理过程。噻唑烷二酮类药物（thiazolidinediones，TZDs）是人工合成的PPARγ配体，其药理作用包括上调靶组织对胰岛素的敏感性、减轻胰岛素抵抗，从而降低血糖水平、纠正紊乱的脂类代谢，还包括抑制炎症反应、减轻心肌纤维化重构等作用。有研究报道，TZDs代表性药物——罗格列酮（Rosiglitazone，Ros）能改善糖尿病患者的胰岛素抵抗[3-4]。但目前，关于Ros对糖尿病心肌纤维化的影响研究较少。论文发表本研究模拟高糖环境下，观察Ros对新生大鼠心脏成纤维细胞Ⅰ型胶原表达的影响，为临床糖尿病、糖尿病心肌病的治疗及预防，改善心肌纤维化提供新的思路。

　　1材料与方法

　　1.1主要仪器与试剂

　　恒温振荡器（THZ-C）购于中国江苏太仓试验设备厂；PCR仪购于ABI公司；GDS-8000凝胶成像分析系统购于美国UVP公司；DU70紫外分光光度计购于美国Beckman公司。胎牛血清购于中国北京索来宝公司；D-葡萄糖（分析纯）购于重庆北碚化学试剂厂，按浓度分为正常血糖浓度（5.5mmol/L，NG）和高糖浓度（30mmol/L，HG）；Ros购于美国Santa公司；兔抗大鼠Ⅰ型前胶原抗体购于美国Santa公司；Trizol试剂购于SBS公司。

　　1.2细胞提取及培养

　　日龄2～3dSprague-Dawley大鼠，雌雄不限，清洁级，由河北医科大学实验动物中心提供。剪取乳鼠心脏前1/3的心室部分，利用消化酶法及差速贴壁法去除未贴壁的心肌细胞，提取培养乳鼠心脏成纤维细胞，传代培养，实验用2～3代传代细胞。

　　1.3分组及处理

　　将D-葡萄糖溶解、过滤除菌后加入6孔板中，每孔2mL，配制分组，30mmol/L高糖孵育6h后，应用0.1%胎牛血清DMEM培养基继续培养24h，将细胞进行分组，其中3组分别加入终浓度为20、30、50μmol/L的Ros干预12h以检验不同浓度Ros对Ⅰ型前胶原表达的影响；另有3组均加入30μmol/L的Ros分别干预18、24、36h以检验不同干预时间对Ⅰ型前胶原表达的影响。另设HG模型组（仅HG干预）及空白对照组（0.1%胎牛血清DMEM培养基+NG干预）。即8个分组分别为：①空白对照组（0.1%胎牛血清DMEM培养基+NG）；②HG模型组；③HG+10μmol/LRos组；④HG+30μmol/LRos组；⑤HG+50μmol/LRos组；⑥HG+30μmol/LRos18h组；⑦HG+30μmol/LRos24h组；⑧HG+30μmol/LRos36h组。

　　1.4Real-timePCR检测Ⅰ型前胶原mRNA的表达

　　检测物（Ⅰ型前胶原）的引物序列全部由美国GeneCopoeia公司提供。Ⅰ型前胶原引物序列：上游5′-GGACCTGTGATGTGCAAAGT-3′，下游5′-CACGGGTAATTCTGTTCTTC-3′，扩增片段418bp；以β-actin作为内参照，引物序列：上游5′-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3′，下游5′-ATCGTACTCCTGCTYGCTGA-3′，扩增片段232bp。采用TRIZOL法遵照SBS公司相关说明书进行心脏成纤维细胞总RNA的提取：取适当稀释的RNA样品，用DU70紫外分光光度计测定所抽提RNA的浓度和纯度，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性。A260/A280=1.8～2.0方可使用，总RNA浓度=A260×稀释倍数×0.04（μg/μL），用前调整为1μg/μL。按M-MLVReversetranscriptase操作说明合成cDNA第一链；取反转录产物进行Real-timePCR反应，反转录产物50倍稀释后按以下体系进行Real-timePCR反应：2×ALL-in-OneqPCRMix（10μL）；ALL-in-OneqPCRprimer2μL；1ststrandcDNA（5倍稀释液）（2μL）；50×RoxReferenceDye（0.4μL）；ddH2O（5.6μL）FinalVolume（20μL），反应条件：95℃10s，60℃20s，72℃15s，反应40个循环，反应结束后，立即进行融解曲线分析。GDS-8000凝胶成像分析系统测定电泳条带的光密度值，根据ComparativeDelta-deltaCt法ΔΔCt=干预组（CtmRNA-CtGAPDH）-对照组（CtmRNA-CtGAPDH），利用2-ΔΔCt计算干预组mRNA光密度与对照组光密度的比值×100%。

　　1.5Westernblot分析检测Ⅰ型前胶原蛋白的表达

　　胰酶消化收集心脏成纤维细胞于离心管中，离心后加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂RIPA，离心后用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量，分装上清用于加样。配制9%的分离胶及4%的浓缩胶，将总蛋白加至上样孔中，进行SDS-PAGE恒压电泳，染色转膜后，杂交、显色，用封闭液将一抗稀释（抗Ⅰ型前胶原1∶500）。包被一抗、二抗，膜用TBST液洗3次，每次5min，采用ECL发光试剂盒显色。膜洗涤完毕置于保鲜膜上，滴加底物工作液后用保鲜膜包好，放入暗室。在暗室中将X光片小心地压到保鲜膜上，依顺序进行曝光、显影、定影。采用凝胶图像分析系统对吸光度进行测量。

　　1.6统计学方法

　　采用统计软件SPSS13.0对实验数据进行分析，正态分布计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用Student-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1不同浓度罗格列酮对高糖诱导的心肌成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA及蛋白表达的影响

　　基础生理状态下，体外培养的心肌成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA和蛋白呈低表达，HG模型组Ⅰ型前胶原mRNA[（109±11）%]和蛋白（1.57±0.02）的表达与空白对照组[（40±3）%、（0.82±0.04）]比较显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。浓度依赖性实验结果显示，HG+10μmol/LRos组Ⅰ型前胶原mRNA[（91±9）%]和蛋白（1.35±0.03）的表达低于HG模型组[（109±11）%、（1.57±0.02）]；HG+30μmol/LRos组Ⅰ型前胶原mRNA[（62±5）%]和蛋白（1.08±0.04）的表达低于HG+10μmol/LRos组[（91±9）%、（1.35±0.03）]；HG+50μmol/LRos组Ⅰ型前胶原mRNA[（51±4）%]和蛋白（0.93±0.02）的表达低于HG+30μmol/LRos组[（62±5）%、（1.08±0.04）]，差异均有统计学意义（P<0.05）。以上结果显示，Ros呈明显的浓度依赖性的下调Ⅰ型前胶原mRNA和蛋白的表达。见表1、2及图1。