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    [摘要]： 【目的】制备雷公藤红素（Cel） 醇质体， 并考察醇质体作为雷公藤红素经皮给药载体的渗透特性。【方法】采用乙醇注入法制备雷公藤红素醇质体， 并对其包封率、粒径、多分散指数（PDI） 及Zeta 电位进行分析； 采用TP2A 型智能透皮试验仪进行体外透皮试验， 比较雷公藤红素醇质体、空白醇质体/Cel 溶液和Cel 溶液的透皮行为。【结果】此方法制备的雷公藤红素醇质体为类球形结构， 平均粒径为（401.3 ± 5.5） nm， PDI 为（0.21 ± 0.02）， Zeta 电位为（－2.75 ± 0.1） mV， 平均包封率为（80.6 ± 0.7）%； 醇质体48 h 的累积透过量76.86 μg·cm-2， 渗透速率为1.640 9 μg·cm-2·h-1， 与空白醇质体/Cel 溶液和Cel 溶液比较， 均有显著提高。【结论】雷公藤红素醇质体的包封率较高， 粒径分布均匀， 质量稳定， 且可显著促进雷公藤红素的透皮吸收。
　　[关键词]： 雷公藤红素/生产和制备； 醇质体/超微结构； 包封率； 体外透皮； 疾病模型， 动物； 小鼠
　　雷公藤可祛风除湿， 通络止痛， 消肿止痛， 解毒杀虫， 可用于治疗湿热结节、癌瘤积毒， 有抗肿瘤、抗炎等作用。雷公藤红素（Celastrol， Cel） 来源于卫矛科植物雷公藤的根、叶及花， 是一种醌甲基三萜［1］类化合物， 分子式为C29H38O4。Cel 可以抑制由脂多糖（LPS）、干扰素－γ （IFN-γ）、双链RNA及抗原抗体的相互作用引起的炎症反应［2-3］。且据文献报道Cel 有抑制血管生成和诱导癌细胞凋亡的作用， 抑瘤率高达65% ～ 93%， 超过紫杉醇［4］。但其难溶于水、毒性大、生物利用度低， 限制了它的临床应用。
　　醇质体作为一种新型的载药脂质囊泡， 可以包载各种类型的药物， 如水溶性、脂溶性、两亲性及蛋白多肽类药物等。将药物包裹于醇质体中， 以经皮给药的方式作用于皮肤不仅可以避免肝首过效应， 减少对消化道的刺激， 还能提高药物的透皮吸收速率和累积透过率［5］； 同时由于皮肤可作为药物储库， 可达到药物缓释的作用， 这样药物的生物利用度就得到了进一步的提高， 最终达到减少剂量、降低不良反应的作用［6］。本研究将雷公藤红素制备成醇质体， 并对其制备工艺及体外透皮性能进行相关研究， 为研制雷公藤红素的新型透皮制剂提供参考， 现报道如下。
　　1 仪器与试药
　　1. 1 仪器CAV214C 电子天平（奥豪斯国际贸易有限公司）； HJ-1 磁力加热搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）； U-3000 高效液相色谱仪（HPLC， 美国戴安公司）； ZetaPALS 激光散射粒径测定仪（美国布鲁克海文仪器公司）； TP2A 型智能透皮试验仪（巩义市英峪予华仪器厂）； QL-901 旋涡混合器（江苏海门市麒麟医用仪器厂）； KQ-300TDB 型高频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公
　　司）。
　　1. 2 试剂Cel 原料药、Cel 对照品（中科院武汉植物园， 批号： 20130524）； 蛋黄卵磷脂（国药集团化学试剂有限公司， 批号： 20131031）； 胆固醇（国药集团化学试剂有限公司， 批号： 20120928）；吐温80 （ 国药集团化学试剂有限公司， 批号：
　　20121225）； 甲醇（色谱纯）； 乙醇、冰醋酸（均为分析纯）。
　　1. 3 动物昆明种雌性小鼠， SPF 级， 体质量18～ 22 g， 由湖北省实验动物研究中心提供， 许可证号： SCXK （鄂） 2008-0005。
    2 方法与结果
　　2. 1 含量测定
　　2. 1. 1 色谱条件Agilgent HC-C18
　　柱（250 mm ×
　　4.6 mm， 5 μm）； 柱温35℃； 流动相为甲醇∶ 体积分数1%冰醋酸（体积比为90 ∶ 10）； 检测波长425nm； 流速为1 mL/min； 进样量20 μL。
　　2. 1. 2 标准曲线的绘制精密称取Cel 对照品10mg， 置于100 mL 量瓶中， 用无水乙醇溶解、稀释并定容， 即得到浓度为100 μg/mL 的Cel 母液。分别将上述母液稀释成质量浓度为10.0、20.0、40.0、50.0、60.0、80.0、100.0 μg/mL 的一系列标准溶液， 以峰面积（A） 为纵坐标， 质量浓度(ρ) 为横坐标， 所得线性回归方程为A=0.505 4 ρ-0.047 9（r=0.999 8） 。结果表明： Cel 检测浓度在10.0 ～100.0 μg/mL 范围内与峰面积呈良好线性关系。
　　2. 1. 3 精密度实验取2.1.2 项下10.0、50.0、100.0 μg/mL 的标准溶液， 于1 d 内连续进样5 次，计算日内相对标准偏差sR； 不同天内， 每日进样1次， 连续进样5 d， 计算日间sR。结果日内sR分
　　别为1.3%、1.1%、0.6%， 日间sR
　　分别为2.3%、
　　1.6%、0.9%。
　　2. 1. 4 稳定性考察精密吸取2.1.2 项下的Cel 母液， 照2．1．1 项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、12、24、48 h 进样测定Cel 的峰面积， sR
　　为1.1%，
　　表明Cel 标准溶液在48 h 内稳定。
　　2. 1. 5 回收率实验精密移取1.0 mL 空白醇质体， 分别加入到10.0、50.0、100.0 μg/mL 的Cel标准溶液中， 每种浓度各3 份， 混合均匀后在10 000 r/min 离心20 min， 取上清液按2.1.1 项下的色谱条件测定， 计算回收率。结果10.0、50.0、100.0 μg/ml 的平均回收率分别为97.7%、98.2%、98.82%， sR
　　分别为0.58%、0.6%、0.6%。
　　2. 1. 6 醇质体包封率的测定采用超离心法［7］测定醇质体的包封率： 精密移取Cel 醇质体1 mL 于离心管中， 于4℃下离心， 10 000 r/min 离心20min， 取上清液， 补足溶剂（与处方量相同浓度的乙醇水溶液）， 同条件下再次离心， 合并上清液测定上清液中Cel 量（m1）； 另取醇质体混悬液1 mL于10 mL 容量瓶中， 甲醇定容， 超声15 min 破乳，测得总药量（m）， 包封率按下式计算： p 包封率(%) =（1 - m1/m） × 100%。
　　2. 2 样品的制备
　　2. 2. 1 Cel 醇质体的制备采用乙醇注入法［8］制备醇质体。精密称取一定量Cel、蛋黄卵磷脂、胆固醇于小烧杯中， 加入无水乙醇溶解， 构成有机相；另取一定量超纯水加入平底烧瓶中， 置于磁力搅拌器（700 r/min） 上， 构成水相。将有机相用1 mL注射器针头缓慢加入至水相中， 注完后继续搅拌2h， 搅拌温度保持在50℃， 自然冷却后超声30min， 将所得混悬液用0.45 μm 孔径有机系滤膜过滤， 即得。同法制备空白醇质体。
　　2. 2. 2 Cel 溶液与空白醇质体/Cel 溶液的制备称取一定量Cel 于10 mL 容量瓶中， 乙醇定容， 得Cel 储备液， 取1 mL 上述储备液至10 mL 容量瓶中， 以透皮接受液［含体积分数20%乙醇， 0.5%吐温80 的磷酸盐缓冲液（PBS） 液］ 定容， 得Cel溶液。分别取等体积的空白醇质体和Cel 溶液， 混匀， 即得空白醇质体/Cel 溶液。制备的Cel 醇质体、空白醇质体/Cel 溶液和Cel 溶液中所含Cel 量应相同。
　　2. 3 正交实验设计方案及结果根据预实验确定了影响Cel 醇质体包封率的主要因素为Cel (A）、蛋黄卵磷脂（B）、胆固醇（C） 及乙醇体积分数（D)， 综合考虑醇质体的包封率及稳定性， 确定了不同因素水平。具体情况如下： 蛋黄卵磷脂用量为150 ～ 350 mg 时， 醇质体的粒径会随着增大， 包封率则先增加后减小； 当蛋黄卵磷脂用量为400 mg时， 醇质体出现分层现象， 因此， 最终确定蛋黄卵磷脂用量为150 ～ 350 mg。醇质体的包封率随着Cel 用量的增加而增大， 但当Cel 用量为20 mg 时，醇质体出现分层现象且部分Cel 析出， 说明此时已经超过了载体的最大载药量， 因此， 最终确定Cel用量为5 ～ 15 mg。醇质体的包封率随着胆固醇用量的增加而增大， 但胆固醇用量为200 mg 时， 虽然醇质体的包封率较高， 但放置几个小时后会有部分胆固醇析出， 因此， 最终确定胆固醇用量为50 ～ 150 mg。
　　乙醇体积分数为20%时， 包封率较小， 当乙醇体积分数为40%时， 产生絮状沉淀， 因此， 最终确定乙醇体积分数为25% ～ 35%。
　　对上述4 个因素3 个水平进行正交实验， 因素水平见表1， 以包封率为考察指标来优化处方， 采用“正交设计助手” 处理实验结果， 正交实验及方差分析结果分别见表2、表3。
　　由表2 可知， 各因素对包封率的影响程度为
　　B>C>D>A， 说明蛋黄卵磷脂用量、胆固醇用量、乙醇体积分数和Cel 用量对包封率的影响依次减弱， 其中各因素水平分析结果分别为A3>A2>A1，B2>B1>B3、C3>C2>C1
　　和D3>D1>D2， 故初步得出醇质
　　体的最佳处方为A3B2C3D3。按初步最优处方制备3批Cel 醇质体， 发现醇质体不稳定， 出现分层现象； 由表3 可知Cel 对包封率的影响最小且无显著930 广州中医药大学学报 2015 年第 32 卷
　　性， 因此将Cel 的用量调整到10 mg， 其他因素不变， 同样制备3 批， 得到的Cel 醇质体稳定性好，且包封率较高， 因而确定最终的最优处方为
　　A2B2C3C3， 即各处方用量分别为： Cel 10 mg、蛋黄卵磷脂250 mg、胆固醇150 mg、乙醇体积分数
　　35%。
　　2. 4 粒径（size） 及Zeta 电位的测定取Cel 醇质体混悬液适量， 与处方量相同浓度的乙醇水溶液作为样品稀释液， 采用ZetaPALS 激光散射粒径测定仪测定Cel 醇质体的Size、多分散指数（PDI）及Zeta 电位， 粒径分布见图1。由图1 可知Cel 醇质体的粒径基本呈正态分布， 测得的粒径平均为（401.3 ± 5.5）nm， Zeta 电位为（－2.75 ± 0.1）mV，PDI 为（0.21 ± 0.02）。
　　吸取醇质体混悬液少许滴于有支持膜的铜网
　　上， 用滤纸吸去多余样品， 晾干。滴一滴磷钨酸溶液于铜网上染色2 ～ 3 min， 滤纸吸去多余液体，晾干， 在透射电镜下观察其粒径大小和形态， 结果见图2。从图2 可以看出制得的Cel 醇质体为类球形， 分布较均一。
　　2. 6 验证试验按优化后的处方工艺制备3 批