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　　1.2.3 小鼠实体瘤瘤体的获取 三组小鼠经10 d连续给药后，在末次给药之后的24 h，经测量全部小鼠的体重后颈椎脱臼处死并且解剖，分别剥离其瘤体，清除非肿瘤组织，称取重量，计算平均重量，计算肿瘤生长抑制率。肿瘤生长抑制率=（模型组平均瘤重-环磷酰胺组平均瘤重）/模型组平均瘤重×100%。

　　1.2.4 组织蛋白的制备 每组小鼠各取4个肿瘤物混合后放入预冷的组织研磨器内，空白组选取部位为小鼠上肢部分肌肉。每个研磨器内加入裂解液500 μL，内含蛋白酶抑制剂（PMSF）2 μL，冰上研磨30 min后转入离心管中，静置10 min后12000 r/min低温离心15 min（4℃），吸取上清，以备蛋白含量检测。

　　1.2.5 蛋白质浓度测定 采用BCA法。将制备好的组织蛋白利用蛋白定量试剂盒进行含量检测。

　　1.2.6 蛋白免疫印迹（Western blot）法 取50 μg蛋白加入等体积的蛋白变性液，煮沸10 min后，进行12%的SDS-PAGE电泳，然后电转至PVDF膜、封闭后，分别加入P53、P21、Bcl-2一抗，4℃过夜，TBST缓冲液洗膜后，加入HRP标记好相应的二抗，待洗膜后，用发光试剂盒ECL法在暗室中发光、曝光、显影、定影。具体方法参考文献[5]。

　　1.2.7 图像分析 采用Alpha Ease FC 4.0软件进行光密度分析，以β-actin条带的平均光强度为内参照，结果以蛋白的相应水平与β-actin的比值表示。

　　1.3 统计学方法

　　采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 肿瘤生长小鼠的一般情况

　　模型组肿瘤小鼠明显出现精神萎靡不振、食欲较差、畏寒群聚、扎堆、体毛稀疏且干涩、动作迟缓而懒动的情况，个别出现瘤皮破溃、腹水形成等生理的异常变化，并且有3只动物死亡；而环磷酰胺组小鼠的状况较模型组好，但极个别也有少毛和脱毛、精神萎靡、懒动等情况，有1只小鼠死亡。

　　2.2 S180肉瘤对小鼠肿瘤形成的影响

　　模型组小鼠在接种后出瘤现象早，发展快，在剥离瘤块时有不易剥离现象，有的质地软烂，有的分界不清，有的甚至粘连到锁骨和胸骨，说明模型组小鼠荷瘤成功。与空白组比较，模型组出现肿瘤，模型组肿瘤与环磷酰胺组比较，瘤重显著增大，两组差异有高度统计学意义（P < 0.01），环磷酰胺抑瘤率为83.63%。见表1。

　　表1 各组肿瘤组织情况（x±s）

　　注：与模型组比较，*P < 0.01；“-”表示无数据

　　2.3 肿瘤组织中各蛋白表达情况

　　空白组与模型组、空白组与环磷酰胺组比较，3种蛋白表达水平差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；与环磷酰胺组比较，模型组P53、P21表达量明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05），其中，P21表达差异有高度统计学意义（P < 0.01），而Bcl-2表达变化不大，差异无统计学意义（P=0.66）。见表2、图1。

　　表2 三组P53、P21、Bcl-2蛋白表达水平比较（x±s）

　　注：与空白组比较，②P < 0.01 ；与模型组比较，③P < 0.05，④P < 0.01

　　1.模型组；2.空白组；3.环磷酰胺组

　　图1 Western blot 法检测3种蛋白表达情况