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　　摘要：以氯氰菊酯为惟一碳源与氮源，从生产氯氰菊酯的农药厂污水曝气处理池的活性污泥样品中，通过富集驯化和划线分离，筛选出一株氯氰菊酯的高效降解菌DZS-3。经气相色谱检测，3d内其对氯氰菊酯的降解率为65.7%。形态学观察，该菌圆形，周边光滑，革兰氏染色鉴定为革兰氏阴性菌。通过16S rDNA序列分析及生理生化特性鉴定，将其初步鉴定为寡养单胞菌属的一种（Stenotrophomonas sp.）。

　　关键词：氯氰菊酯降解菌;筛选;鉴定;寡养单胞菌属（Stenotrophomonas sp.）

　　中图分类号：X172;Q93-331        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）23-5708-05

　　拟除虫菊酯类（Synthetic Pyrethroids）杀虫剂是一类具有优异生物活性、环境相容性较好的农药，它是继有机磷、有机氯和氨基甲酸酯之后发展起来的一类杀虫剂[1]。该类杀虫剂是模拟植物源农药——天然除虫菊酯合成的一类含有多个苯环结构的化学农药[2，3]。

　　氯氰菊酯是拟除虫菊酯类杀虫剂中的一种，具有高效、广谱、低毒等优点，被广泛应用于果树、蔬菜的病虫防治，但其在环境中有一定的蓄积性，很难在自然条件下快速降解。氯氰菊酯的广泛使用，造成了其在农产品上的大量残留和土壤、河流的污染，给生态环境和人类自身的健康安全带来了极大的威胁。农药残留是影响我国农产品出口的重要屏障，农药残留超标势必给我国的经济造成极大的损失。虽然国内外关于处理拟除虫菊酯类农药残留的方法有很多的报道，但都不能从根本上消除农药残留的问题。如何有效地解决菊酯类农药残留的问题，成为当前人们面临的一大难题。残留在环境中的氯氰菊酯可以通过光降解、化学降解以及微生物的作用被降解。而与化学降解和光降解等方式相比较而言，农药的微生物降解具有安全、高效、费用低、无二次污染等优点，所以，以微生物降解为基础的生物修复是一种环境友好型污染物消除技术，也是去除氯氰菊酯残留的一种有效的手段。本研究旨在于分离筛选出新的高效降解氯氰菊酯的菌株，检测其对氯氰菊酯的降解能力，探讨直接用于氯氰菊酯引起的环境污染的微生物修复的可能性。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  主要仪器设备  自动凝胶成像分析仪，PCR 扩增仪，电泳仪，全自动高压蒸汽灭菌锅，恒温摇床，超净工作台，显微镜，生化培养箱，紫外-可见分光光度计（PE Lambda 25），气相色谱仪（Agilent）。

　　1.1.2  采集样品  从江苏某农药厂曝气池排污口附近土壤采集样品。

　　1.1.3  试剂  K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、FeSO4、NaCl、氯仿、环己烷均为分析纯，琼脂，牛肉浸取物，胰蛋白胨（Tryptone），酵母提取物（Yeast extract），氯氰菊酯原药（纯度94%）（氯氰菊酯原药使用前先用乙醇或正己烷配成高浓度母液，并过滤除菌）。

　　1.1.4  扩增16S rDNA 引物  primer 27F： 5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′; primer 1492R： 5′GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

　　1.1.5  培养基

　　1）基础培养基：MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4·3H2O 1.5 g，KH2PO4 0.5 g，FeSO4·7H2O 1.0 g，去离子水1 L。

　　2）增菌富集培养基：蛋白胨 2.0 g，NaC1 1.0 g，牛肉膏 1.0 g，去离子水 l L，pH 7.0～7.2。

　　3）LB培养基：NaCl 10 g，Yeast extract 5 g，Tryptone 10 g，去离子水 l L，pH 7.0。

　　往上述培养基中加入2%的琼脂粉即为固体培养基。

　　1.2  方法

　　1.2.1  氯氰菊酯降解菌的分离纯化  称取污泥5 g，加入灭菌的装有100 mL去离子水的三角烧瓶中，170 r/min、30 ℃，在摇床上振荡1周，充分释放污泥中的微生物[4]，然后将上清液5 mL和曝气池液体5 mL加入到含氯氰菊酯浓度为50 mg/L的100 mL液体基础培养基中，在摇床上30 ℃、170 r/min培养。按3%的接种量，每7 d转接1次，每转接1次氯氰菊酯浓度提高50 mg/L，直到氯氰菊酯浓度为250 mg/L。交替使用乙醇和正己烷溶解氯氰菊酯以消除溶剂对试验的干扰，确保筛选出的菌株能够利用氯氰菊酯农药作为惟一碳源、氮源生长。取菌液按100，10-2 ，10-4，10-6 进行做4个梯度的稀释（每个梯度设3个重复）后涂布于含氯氰菊酯的固体基础培养基平板上，于30 ℃培养箱中培养。待长出菌落后，按照菌落形态、大小、颜色不同挑取单菌落在含氯氰菊酯的固体基础培养基平板上划线分离，纯化菌株，直到得到单一、均匀的单菌落。

　　1.2.2  紫外分光光法初步鉴定高效降解菌株  将筛选得到的生长良好的单菌落接入3 mL液体富集培养基中，30 ℃、170 r/min摇床过夜培养。按3%的接种量将过夜培养的菌液转接到含100 mL富集培养基的三角瓶中，培养至OD600 nm=0.6左右，7 000 r/min、5 min离心收集菌体。并用磷酸缓冲液洗两次。用磷酸缓冲液悬浮菌体，并调OD600 nm=1.0。按3%的接种量接种到5瓶10 mL的液体基础培养基中（氯氰菊酯浓度为100 mg/L）培养，以不加菌为对照，1、3 d 取样，每个样做3个重复，以三氯甲烷为萃取剂双倍体积萃取。三氯甲烷萃取后用紫外可见分光光度计于200～700 nm波长下扫描确定氯氰菊酯的特征吸收峰，检测氯氰菊酯的降解情况，以确定降解效果最好的菌株。 

　　1.2.3  高效降解菌株降解率的确定  将降解效率最高的菌株按与“1.2.2”基本相同的步骤操作，其中氯氰菊酯的含量为10 mg/L，取样点为1 、3 、5 、7 、9 d。最后用环己烷双倍体积萃取氯氰菊酯，无水硫酸钠除去样品中的水，每个样做3个重复，用气相色谱检测氯氰菊酯的含量。

　　气相色谱条件[5]：气相色谱仪为7 890A（带工作站），载气：99.999%N2，平均线速度：65 cm/L，不分流进样，进样量为1 μL ，毛细管柱（30 mm×0.53 mm× 1.5 μm）。进样口温度为250 ℃，ECD检测器，检测器温度为300 ℃，柱温采用程序升温：初温为150 ℃升温至280 ℃，在此温度保持10 min。

　　1.2.4  高效降解菌生长曲线的绘制  将对氯氰菊酯降解率最高菌株富集后按1%的接种量接种到含0.01%的Yeast extract的液体基础无机盐培养基中，30 ℃、170 r/min培养，0、1、3、5、7 、9 d取样，测定其相应的OD600 nm，以培养时间为横坐标，菌液OD600 nm为纵坐标，绘制生长曲线。

　　1.2.5  氯氰菊酯降解菌的鉴定

　　1）染色。常规染色观察菌株的形态学特征，革兰氏染色检测参照文献[6]。

　　2）16S rDNA序列系统发育分析。将菌体接种到富集培养基中培养过夜，取100 μL菌液离心，用灭菌水洗两遍，再用100 μL灭菌水悬浮菌体，沸水中煮10 min，再放置冰上5 min，12 000 r/min离心5 min，取上清作为模板直接PCR。

　　PCR反应体系（25 μL）：rTaq 酶（5 U/μL） 0.2 μL，10×PCR buffer（Mg2+ Plus）2.5 μL，dNTP（2.5 mM）2 μL，上清液 2 μL，上游引物 0.3 μL，下游引物 0.3 μL，灭菌水 17.7 μL。

　　PCR反应条件为：95 ℃ 5 min;95 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min30 s，30个循环;72 ℃ 8 min。

　　将PCR产物用0.8%的琼脂糖凝胶电泳，将条带单一，清晰的PCR产物切胶回收。将回收片段与pGEM–T Easy载体于4 ℃连接过夜，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。随即挑取几个转化子抽提质粒，酶切检测。将含有目的条带的转化子送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序。医药卫生

　　3）生理生化鉴定。为明确菌株的生理生化特性，对菌株作了以下试验：碳源利用试验，产酸试验，产H2S试验，淀粉水解试验，甲基红试验，明胶液化试验，V.P.试验，吲哚试验。试验方法参照文献[6]。

　　1.2.6  菌株对抗生素的敏感性  将菌株用富集培养基培养后，取10 μL接入含相应抗生素的LB培养基中，观察菌株在抗生素种类和浓度的敏感性。其中，抗生素的浓度分别为氨苄青霉素60 、20、10 μg/mL;卡那霉素50、10、2 μg/mL;链霉素50、10、2 μg/mL;氯霉素100、25、5 μg/mL。

　　2  结果与分析