论文投稿_医学论文投稿_核心期刊,职称论文投稿发表_论文部落

　　2.1  氯氰菊酯降解菌的筛选

　　从生产氯氰菊酯的工厂附近采集样品，以氯氰菊酯为惟一碳源、氮源筛选具有降解农药能力的微生物。通过在含有氯氰菊酯的无机盐培养基中反复驯化以及无机盐平板上多次划线分离、纯化，初步得到9株降解氯氰菊酯的菌株。为维持降解菌降解能力的稳定性，后经进一步的复筛，将筛选得到的9株降解菌经过扩大培养、涂布含氯氰菊酯的无机盐平板，得到3株生长良好的降解菌。经紫外扫描分析，氯氰菊酯在278 nm处有最大吸收峰，确定一株高效降解氯氰菊酯的菌株，命名为DZS-3。图1为3 d内菌株DZS-3对氯氰菊酯降解情况及对照的紫外扫描图。

　　2.2  DZS-3对氯氰菊酯的降解率及降解趋势

　　氯氰菊酯降解率=[1-（实测残量/对照样实测残量）]×100%[7]。

　　气相色谱的灵敏度较高，为精确计算高效降解菌DZS-3的降解率，实验室用气相色谱检测了氯氰菊酯的含量。氯氰菊酯经DZS-3作用3 d后，DZS-3对氯氰菊酯的降解率为65.7%。图2为经气相色谱检测，DZS-39在9 d内对氯氰菊酯的降解情况。

　　由图2可以看出，前3 d DZS-3对氯氰菊酯的降解速率较快，3 d后降解逐渐变缓慢。可能是氯氰菊酯在降解的过程中产生了对其自身降解有抑制作用的中间产物。

　　2.3  高效降解菌生长曲线

　　该菌体的生长曲线（图3）与常规的生长曲线不同，一般生长曲线包括滞后期、指数期、稳定期和衰退期，而该菌的生长曲线没有稳定期。可能是氯氰菊酯在降解的过程中产生了某些严重抑制DZS-3生长的代谢产物，使菌体细胞迅速死亡裂解。

　　2.4  氯氰菊酯降解菌的鉴定

　　2.4.1  氯氰菊酯降解菌DZS-3的形态特征  通过简单染色、革兰氏染色等生物学技术初步鉴定DZS-3降解菌的形态特征。菌落为针尖状，表面光滑，无颜色，有轻微的气味，显微镜下形状呈短杆状。经革兰氏染色鉴定，DZS-3为革兰氏阴性菌。

　　2.4.2  16S rDNA同源性比较  为了确定降解菌的种类，采用比较常用的分类学指标——16S rDNA序列同源性比较。

　　通过菌落PCR扩增16S rDNA，扩增产物经过0.8%的琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小如图4所示。将扩增得到的16S rDNA片段的测序结果与NCBI数据库中的16S rDNA序列进行对比，菌株DZS-3与嗜麦芽寡养单胞菌PSM-2的16S rDNA一致性达到99%，将其初步鉴定为寡养单胞菌属的一种。 

　　应用序列比对软件ClustalX 1.8软件对菌株的16S rDNA序列与相似性较高的16S rDNA序列进行比对，用系统发育分析软件Mega 5.03构建系统发育树，DZS-3系统发育进化树见图5。

　　2.4.3  DZS-3生理生化特性  DZS-3生理生化实验结果见表1。表1结果与嗜麦芽寡养单胞菌的模式菌株ATCC13637的特性除少数不同外基本上一致，模式菌株不能产酸，可以液化明胶，DZS-3可以产酸但不能液化明胶。

　　2.5  菌株对抗生素的敏感性

　　为明确DZS-3对各种抗生素的敏感性，对氨苄青霉素、卡那霉素、链霉素、氯霉素等4种抗生素做了抗性试验。每种抗生素做了3个不同浓度梯度， DZS-3在加有不同浓度抗生素氨苄青霉素、卡那霉素、链霉素的LB培养基中均表现出良好的生长状态，但是在氯霉素中不能生长。表明DZS-3在试验浓度内对氨苄青霉素、卡那霉素、链霉素都有抗性，对氯霉素敏感。由于DZS-3对多种抗生素具有抗性，这将影响其以后在环境中释放和应用。

　　3  讨论

　　氯氰菊酯在水中的溶解度非常低（大约0.1 mg/L），所以氯氰菊酯在使用前通常将其溶解在有机溶剂（如乙醇、正己烷）中以增加其溶解度。在筛选降解菌的过程中为防止筛选到的降解菌利用溶剂为碳源、氮源生长，采用乙醇和正己烷交替使用。通过反复的初筛和复筛，从生产氯氰菊酯的农药厂污水曝气处理池活性污泥中分离筛选一株氯氰菊酯的高效降解菌DZS-3，通过气相色谱分析其3 d内对10 mg/L的氯氰菊酯的降解率为65.7%。经形态学研究及革兰氏染色，该菌属于革兰氏阴性菌，菌落为针尖状，表面光滑，显微镜下呈短杆状。经16S rDNA序列同源性分析及生理生化特性鉴定，将其鉴定为寡养单胞菌属的一种。

　　在对降解菌初筛时，采用紫外-可见分光光度法测定氯氰菊酯的含量，以氯仿为萃取剂，而氯仿本身对细胞膜有一定的破坏作用，在氯仿的作用下导致降解菌DZS-3细胞膜的破损，细胞内容物如蛋白质等渗透出来，被氯仿萃取出来，同时蛋白质的特征吸收峰在280 nm，与氯氰菊酯的特征吸收峰278 nm靠得很近，蛋白质的存在可能会影响氯氰菊酯的特征吸收，故使用分光光度仪只能粗略判定氯氰菊酯的降解情况。气相色谱灵敏度较高，测定的数据能真实反映物质的含量，要精确计算氯氰菊酯的降解率需采用气相色谱法准确测定氯氰菊酯的含量。

　　国内报道的氯氰菊酯降解菌株主要有红球菌（Rhodococcus sp.）[5]，假单胞菌（Pseudomonas sp.）[8，9，10，11]，肠杆菌Enterobacter sp.[9]，中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）[12]，克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）[13]，芽孢杆菌（Bacillius sp.）[14]，产碱菌（Alcaligenes sp.）[15]，Starkeya sp.[16]，苍白杆菌（Ochrobactrum sp.）[17]。国外报道的氯氰菊酯的降解菌株Pseudomonas sp.和Serratia sp. 20 d的降解率只有50%[18]，明显低于本研究分离的菌株DZS-3，分离筛选的这株菌属于寡养单胞菌属，大多属于不可培养微生物，与上述各个实验室报道的氯氰菊酯降解菌不同。菌株DZS-3对多种抗生素具有抗性，所以不能直接释放入环境用于污染环境的修复，但可以作为出发菌株研究氯氰菊酯降解相关酶基因，并且有可能克隆得到新的降解基因。

　　参考文献：

　　[1] 刘尚钟，王  敏，陈馥衡，等.拟除虫菊酯类农药的研究与展望[J].农药，2004，43（7）：289-293.

　　[2] GIRL S，SHARMAG D，GIRL A，et a1.Fenvalerate- induced chromosome aberrations and sister chromatid exchanges in the bone marrow cells of mice in vivo[J]. Mutation Research，2002，520：125-132.

　　[3] TRIPATHI G， VERMA P.Fenvalerate-induced changes in a catfish. clams batrachus：metabolic enzymes，RNA and Protein[J].Comp Biochem Physical Part C，2004，138：75-79.

　　[4] SPITSBERG V L，GOREWIT R C.Solubilization and purification of xanthine oxidase from bovine milk fat globule membrane[J].Protein Expression and Purification，1998，13（2）：229-234.

　　[5] 许育新，戴青华，李晓慧，等.氯氰菊酯降解菌株CDT3的分离鉴定及生理特性的研究[J].农业环境科学学报，2004，23（5）：958-963.

　　[6] 赵  斌，何绍江.微生物实验[M].北京：科学出版社，2002.

　　[7] 刘  艳，范丽薇，王晓萍.氯嘧磺隆降解菌的分离鉴定及其降解特性[J].微生物学通报，2010，37（8）：1164-1168.

　　[8] 张  琛，王圣惠，闫艳春.高效氯氰菊酯降解菌CH7的分离鉴定及降解条件的优化[J].生物技术通报，2010（1）：99-102.