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　　[摘要] 目的：探讨抗癌防移片抑制4T1①乳腺癌血管生成的机理。方法：建立4T1 乳腺癌模型，随机分成空白对照组、模型组、环磷酰胺(Cytoxan,CTX)组和抗癌防移片组各12 只,分别给予药物或生理盐水，给药4 周后处死小鼠，测量剥离瘤重，计算剥离瘤重抑制率以及计数肺转移结节数,并通过免疫组化染色测定肿瘤微血管数与血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)。结果：与模型组比较，抗癌防移片组剥离瘤质量明显减轻（P<0.05），肺转移结节数目明显减少（P<0.05）,且剥离瘤微血管数与VEGF表达有降低趋势。结论：抗癌防移片可能通过靶向VEGF、抑制肿瘤微血管生成从而抑制4T1小鼠乳腺癌生长与转移。
　　[关键词] 抗癌防移片;4T1 乳腺癌;抗血管生成;微血管数;血管内皮细胞生长因子
    乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤,癌组织的侵袭与转移是导致病患死亡的主要原因。大量研究发现，肿瘤侵袭、转移过程的关键步骤是新生血管生成，而血管生成受到促血管生成和抗血管生成因子的严密调控，二者的平衡被打破后往往表现为持续的、失控的血管生成[1].研究表明，血管生成是乳腺癌的一个独立预后因素[2]。血管内皮细胞生长因子（VEGF）是目前最强的直接作用于血管内皮细胞导致血管生成失控的生长因子[3]。自2003 年贝伐单抗（bevacizumb）被FDA 批准治疗结肠癌以来，至今已有多种抗血管生成单克隆抗体被证实具有抗肿瘤的临床疗效[4]。此外，研究表明很多单味中药和中药复方具有抗肿瘤血管新生的作用[5]，如三氧化二砷[6]、复方仙慈丹[7]等。抗癌防移片为湖南中医药大学第一附属医院肿瘤科根据多年临床经验总结的效验方，临床上用于抑制乳腺癌术后的复发与转移取得了良好的疗效[8]。前期实验研究发现抗癌防移片对4T1 乳腺癌具有抑制生长和转移的作用[9]。本研究拟以肿瘤微血管数与血管内皮生长因子为研究对象，探讨“抗血管生成”是否为抗癌防移片的药效机制，为临床应用提供实验依据，现报道如下。
　　1 材料及方法
　　1.1 受试药物及主要试剂
　　抗癌防移片由湖南中医药大学第一附属医院提供，批号：20130521，规格：0.3g/片，每片含生药0.47g；注射用环磷酰胺（CTX）购于江苏恒瑞医药股份有有限公司，国药准字：
　　H32020857，批号：201300830； VEGF 一抗与CD34 一抗，均购于武汉博士德生物工程有限公司,批号：1203209905,效期：201501；山羊抗兔/小鼠IgG 多聚体二抗，购于北京中杉金桥有限公司,批号：1200502405D,效期：201503。
　　1.2 实验动物和细胞株
　　BALB/c 小鼠48 只，雌性，6～8 周龄，体质量18～20g，SPF 级，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号：43004700001380，饲养于湖南中医药大学SPF 级动物实验室；4T1 乳腺癌细胞株购于湘雅医学院细胞培养室，在37℃和5%CO2 充分湿化条件下培养备用。
　　1.3 主要仪器
　　NV-425-400E，细胞培养超净工作台,美国Nuaire；2406-2，水套式C02 培养箱，美国Shellab；XD-101，倒置生物显微镜，南京江南光电股份有限公司；HD-2000，病理图文报告系统，湖北慧达仪器有限公司。
　　1.4 造模及给药
　　造模参照文献方法进行 [10]，随机选取36 只BALB/c 小鼠,选择生长状况良好的4T1 乳腺癌细胞以1×106/mL 的浓度接种于小鼠右侧第二乳头脂肪垫皮下各0.2mL，2 周后测微尺测得乳头皮下移植瘤长到1cm2 左右时，表示移植瘤皮下接种成功。小鼠随机分为空白对照组、模型组、环磷酰胺组与抗癌防移片组。每日以药液或生理盐水灌胃，同时隔日以药液或生理盐水腹腔注射，给药剂量按人鼠体表面积折算法计算[11]，抗癌防移片组生药量为5.2g·kg-1·d-1，环磷酰胺组为0.04g·kg-1·d-1，给药方法具体如下：（1）抗癌防移片组予生药浓度为0.26g/mL 癌防移片悬浊液灌胃，同时予生理盐水腹腔注射；(2)环磷酰胺组予生理盐水灌胃，同时予 CTX 0.04 g·kg-1·d-1 腹腔注射；(3)空白对照组与模型组予生理盐水灌胃与腹腔注射。停药次日脱颈处死小鼠，剥离肿瘤，切取正常瘤组织0.5 cm×0.5 cm×0.5cm投入0.2g/mL 多聚甲醛固定；分离肺组织，将肺组织分离干净后投入到固定液（饱和苦味酸：
　　甲醛：冰醋酸体积比为75:25:5）中固定24h 后用无水乙醇浸泡至肺组织恢复颜色。
　　1.5 检测指标
　　1.5.1 小鼠瘤体质量与瘤体质量抑制率 小鼠处死后，完整剥离肿瘤，精密电子天平秤取剥离瘤质量，计算各组瘤体质量抑制率：P 瘤体质量抑制（%）=（m 模型组-m 药物组）/m 模型组×100%。
　　1.5.2 小鼠肺转移结节数与肺转移抑制率 解剖显微镜下计数肺转移结节数。计算肺转移抑制率（%）=（模型组平均肺表面结节数-治疗组平均肺表面转移结节数）/对照组平均肺转移结节数×100%。
　　1.5.3 CD34 与VEGF 含量测定 以CD34 分子标记4T1 乳腺癌血管内皮细胞,采用ABC 法（亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法）染色，操作步骤按照试剂盒要求进行，小鼠乳腺癌病理切片滴加VEGF 一抗或CD34 一抗，以PBS 代替一抗做空白对照，以已知阳性的切片做阳性对照。采用双盲法在相同条件下观察各组病理切片,判断标准[12,13]：（1）肿瘤微血管数测定(CD34标记内皮细胞):凡呈现棕色单个内皮细胞或内皮细胞簇均视为一个微血管，如管腔面积大于8 个红细胞直径或带有较厚肌层的血管及硬化区域的血管均不计数，每张切片先用低倍镜寻找5 个血管密度最高的区域即“热点”，找到后应用IMS 病理图像分析系统计算200 倍视野中的新生血管数，取其均值作为该样本的测定值。（2）VEGF 含量的测定：运用半定量计分法判定结果，按阳性细胞所占比例评分,阳性染色细胞数<5%为0 分, 5%～10%为1 分, 11% ～50%为2 分,51%～80%为3 分, >80%为4 分；同时按阳性细胞着色程度评分,无着色为0 分,浅黄色为1 分,棕黄色为2 分,棕褐色为3 分，两项评分的乘积为染色分数，切片的染色分数为所选取的5 个高倍视野的染色分数平均值，分值≤2 为阴性(-),分值在≥3 之间为染色阳性(+)。